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第一部分M2型胆碱能受体介导的BK电流在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制目的：大量的研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到的ACh激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导。m2型胆碱能受体属于代谢型受体,其在Ⅱ型前庭毛细胞内的信号转导机制尚不清楚。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器(球囊、椭圆囊、壶腹),酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)细胞内应用100μM/L的GTPyS(一种不能被水解的GTP类似物)引起一持续的外向电流,1-2分钟内电流达到最大(225.8±42.6pA,n=4)；2)细胞外给予10μM/L的GAPnt-2(一种Gi蛋白的a亚单位抑制剂)孵育1分钟,对ACh引起的电流没有影响(ACh,117.6±21.5pA, GAPnt-2+ACh111.6±19.3pA, p=0.14, n=5);然而,细胞外给予Gi蛋白α亚单位和βγ亚单位抑制剂400ng/ml的PTX,4分钟内最大抑制作用为85.3±6.6%(n=5);3)1mM db-cAMP(一种cAMP的类似物)与100μM/L的ACh一起作用于豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞,电流幅度增加了1.3倍(n=5)。然后,给予腺苷酸环化酶抑制剂100μM/L的2,5-dd-Ado1分钟,最大抑制效应是65.9±8.8%(n=5),这时需要孵育3分钟外液才能完全恢复(n6)。结论：通过本研究,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上乙酰胆碱激活的大电导钙激活钾通道是通过m2型胆碱能受体介导的Gi蛋白的βγ亚单位转导,从而影响AC的活性,进一步引起细胞内cAMP的升高,,进一步导致钙通道的磷酸化,钙离子内流,从而激活BK电流。第二部分M2型和α9型胆碱能受体介导的两种不同通道在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存目的：分子生物学研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性传出神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道(SK2)开放。然而我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh作用于M2型胆碱能受体,从而激活细胞内信号转导通路,进一步激活大电导钙激活的钾离子通道(BK)开放。根据以上两种结果的差异性,在本次研究中我们进一步研究这两种不同受体介导的不同通道(SK2和BK)在同一个细胞上的关系。方法：取健康成年豚鼠,麻醉后取出耳蜗,分离出前庭外周终器(球囊、椭圆囊、壶腹),酶消化后,分离出活性良好的前庭毛细胞,置入涂有鼠尾胶原的培养皿中贴壁,在倒置显微镜下选取Ⅱ型前庭毛细胞行全细胞膜片钳研究。结果：1)在胶原酶IA消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到M2型胆碱能受体介导的BK电流；2)在胰酶消化的Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到α9型胆碱能受体激活的SK2电流；3)首先在胰酶消化的毛细胞上我们记录到了α9型胆碱能受体激活的SK2电流,这种电流能被a9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽(apamin)抑制,而不能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明(methoctramine)抑制。然后我们对这个在记录状态下的细胞用胶原酶IA进行消化3分钟。用正常外液孵育5分钟后,再次给予ACh,引起一缓慢激活的不失活的外向电流,这种电流不能被α9型胆碱能受体特异性抑制剂蜂毒明肽(apamin)抑制,而能被M2型胆碱能受体抑制剂美索曲明(methoctramine)抑制。结论：本研究发现M2和a9型胆碱能受体在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上共存,同时BK和SK2通道也共存于同一个细胞上。但是两种不同受体介导的不同通道的激活需要的消化酶不同,从而揭示酶可能对通道具有消化作用。第三部分大电导钙激活的钾通道(BK)和小电导钙激活钾通道(SK2)在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的分布目的：大量的研究证实乙酰胆碱(ACh)是前庭外周传出系统的主要抑制性神经递质。目前认为哺乳动物前庭外周传出神经递质ACh释放作用于Ⅱ型前庭毛细胞上,引起离子型的胆碱能受体α9介导的通道打开,进一步引起钙离子内流,从而激活小电导钙激活的钾离子通道(SK2)开放。并且我们最新研究发现,在豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞上我们记录到ACh通过m2型胆碱能受体激活大电导钙激活钾离子通道(BK)。然而,BK和SK2通道在哺乳动物前庭外周感觉上皮和Scarpa神经节上的分布尚不清楚。方法：采用正常成年大鼠,取内耳行冰冻切片,进行免疫荧光染色,检测BK和SK2在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上的表达。结果：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。1)BK通道选择性的表达于部分Ⅰ型和部分Ⅱ型前庭毛细胞上,而SK2通道表达于所有的Ⅰ型和Ⅱ型前庭毛细胞上；2)SK2通道表达于前庭支持细胞上,而BK通道不表达于支持细胞上；3)SK2通道表达于传入神经末梢上,而BK通道不表达；4)BK和SK2通道都表达于三种类型的Scarpa神经节胞体上。结论：BK和SK2通道在大鼠前庭感觉上皮和Scarpa神经节上均有表达。表明BK和SK2通道不仅在传出神经递质ACh释放调节Ⅱ型前庭毛细胞中起作用,在维持Ⅰ型前庭毛细胞的兴奋性中也可能起重要的作用。同时SK2通道的激活在前庭平衡感觉传入中也起到了重要的调节,但是BK通道不参入这个过程。在Scarpa神经节上BK和SK2通道可能参与了细胞动作电位产生从而调节细胞的兴奋性。