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目的: 1.研究六味地黄丸干预阿霉素肾病模型的实验研究,以及胞红蛋白在阿霉素肾病模型中的作用探讨; 2.研究六味地黄丸含药血清对肾小管上皮细胞HK-2的Smads/MAPK信号通路的影响,为六味地黄丸对糖尿病肾病肾小管间质纤维化的防治提供理论依据。 方法: 体内实验采用尾静脉一次性注射阿霉素建立小鼠肾病模型,六味地黄丸给药干预,通过检测肾系数、尿总蛋白、血肌酐、尿素氮、血总蛋白、白蛋白,观察模型建立及六味地黄丸干预后生化改变;检测血甘油三酯、胆固醇,观察六味地黄丸对脂质肾毒性的作用;检测超氧化物歧化酶(Superoxyde dismutase,SOD)活性、丙二醛(Methane Dicarboxylic Aldehyde,MDA)含量,观察氧化应激改变;采用蛋白印迹方法研究各组小鼠肾组织cytoglobin、p38 MAPK、NF-κB p65、nephrin、podocin蛋白表达水平变化;运用光镜和电镜观察各组小鼠肾组织的形态学变化。体外实验基于六味地黄丸干预STZ诱导的糖尿病肾病模型大鼠8周后采集的各组大鼠血清,分别刺激肾小管上皮细胞(HK-2)制备模型组、中药组、对照组等细胞模型;通过MTT、LDH检测结果,选择合适的含药血清浓度进行试验;采用ELLSA法检测药物血清刺激后HK-2细胞培养液TGF-β1细胞因子含量;采用Western Blot方法观测细胞α-SMA、Tβ RⅠ、Smad3、p-Smad3、p38 MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK等蛋白表达水平。 结果: 1.模型组小鼠的肾系数、24小时尿总蛋白含量增加,血尿素氮、胆固醇、甘油三酯含量升高,血清总蛋白、白蛋白降低;肾组织超氧化物歧化酶活性明显下降,丙二醛明显升高;肾组织nephrin和podocin蛋白表达水平降低;胞红蛋白、p-p38MAPK、NF-κB p65蛋白表达升高;光镜观察发现肾小球结构基本正常;电镜观察发现足细胞的足突广泛融合甚或消失。 2.六味地黄丸干预,24小时尿总蛋白含量、血尿素氮、胆固醇、甘油三酯含量下降;血清总蛋白、白蛋白升高;SOD活性增加,MDA含量减少;肾组织nephrin和podocin蛋白表达水平升高;胞红蛋白、p-p38 MAPK、NF-κB p65蛋白表达下降;光镜下肾小球结构正常;电镜下可见足细胞足突广泛扁平融合,但明显轻于模型组。 3.六味地黄丸能够降低肾小管上皮细胞α-SMA的蛋白表达水平。 4.六味地黄丸含药血清能够促使HK-2细胞TβRⅠ、Smad3、p-Smad3、p-p38MAPK、p-ERK的蛋白表达水平下调,对p38 MAPK、ERK的蛋白表达水平没有影响。 结论: 1.成功复制了阿霉素肾病小鼠模型,六味地黄丸对该模型小鼠有防治作用,具体表现在:①能够改善肾功能,降低蛋白尿、血尿素氮、胆固醇、甘油三酯,升高血总蛋白、白蛋白水平;②减轻病理损伤。其机制是①上调SOD活性,降低MDA含量,以减轻肾组织氧化应激损伤;②通过抑制p38 MAPK、NF-κB信号通路的活化,改善肾组织的病理损伤;⑨通过升高足细胞nephrin和podocin蛋白表达,保护足突结构,减少尿蛋白。2.基于STZ诱导的糖尿病肾病大鼠六味地黄丸含药血清能够抑制肾小管上皮细胞TGF-β/Smads和p38 MAPK、ERK的活化,表明肾小管上皮细胞是该药发挥疗效的靶细胞之一,从而抑制DN的进展。