论文部分内容阅读
目的：茶多酚为茶叶中的多酚类物质,其主要活性成分有EGCG、ECG、EC,具有良好的药理活性,但因生物利用度低而影响药物疗效的发挥。本课题拟研究胃肠道主要生理因素对茶多酚稳定性的影响,并模拟其在胃肠道的消化吸收过程,以期找到影响茶多酚生物利用度的胃肠道因素,继而探讨提高茶多酚生物利用度的策略。此外,对茶多酚影响外排转运体P-gp及其机制进行了初步探索,为进一步研究茶多酚的相互作用奠定基础。方法：1.采用HPLC法检测pH、时间、胃蛋白酶、胰酶、胆盐、肠道菌群等胃肠道生理因素对茶多酚中主要成分EGCG、ECG、EC的影响。2.建立Caco-2细胞模型,采用电阻仪测量Caco-2细胞单层的跨膜电阻TEER值、透射电镜观察细胞形态、多功能酶标仪检测阳性对照药荧光黄的表观渗透系数,以对Caco-2细胞模型进行评价；采用CCK-8试验考察茶多酚、配药溶剂及样品对Caco-2细胞的毒性；结合体外消化模型与Caco-2细胞模型,模拟茶多酚在胃肠道的消化吸收过程；采用液质联用检测茶多酚的含量,以表观渗透系数(Papp)为指标,系统分析茶多酚在胃肠道的消化吸收过程。3.采用罗丹明123外排实验确定Caco-2细胞中外排转运体P-gp的活性；荧光定量PCR法检测茶多酚给药浓度和作用时间对P-gp的基因MDR1表达水平的影响；4. WESTERN BLOT法检测茶多酚给药浓度和作用时间对P-gp及NF-κB表达水平的影响。结果：1.pH为1.2-5.8时,pH对茶多酚的影响不大。但pH为5.8-8.0时,随着pH的升高,作用时间的延长,茶多酚稳定性逐渐下降；胃蛋白酶、胰酶和胆盐对茶多酚无影响；肠道菌群对茶多酚的影响最大,作用6h后,茶多酚基本被降解；茶多酚中的三种主要活性成分的稳定性为EO＞ECG＞EGCG。2.Caco-2细胞单层模型培养21天后,电阻TEER值达到400～600之间；荧光黄的表观渗透系数为0.45249×10-6 cm/s＜0.5×10-6 cm/s(通透性实验规定值)；透射电镜下可观察到Caco-2细胞的细胞连接及微绒毛;随着茶多酚给药浓度的升高,Caco-2细胞存活率先平稳后降低。茶多酚浓度为0.25 mg/ml时,Caco-2细胞的存活率为77.0384%;茶多酚浓度为0.5 mg/ml时,Caco-2细胞的存活率为17.9872%;配药溶剂和样品孵育Caco-2细胞2h后,Caco-2细胞的存活率均大于88%,即显著大于50%；茶多酚的主要活性成分EGCG的RPapp (PappBL-AP/PappAP-BL)即外排率>2；EGCG的表观渗透系数很低,加入P-gp的抑制剂维拉帕米后外排率显著下降；EGCG在碱性溶液中的转运量较酸性溶液中的低。3.P-gp的抑制剂维拉帕米可显著抑制P-gp的底物罗丹明123的外排。P-gp的基因MDR1的表达水平随茶多酚给药浓度和给药时间的增加而下调。4.P-gp和NF-κB的表达水平随茶多酚给药浓度和给药时间的延长而下调。结论：1.茶多酚在酸性条件下很稳定,但在碱性溶液中有自动氧化的倾向；胃蛋白酶、胰酶和胆盐对茶多酚无影响；肠道菌群可能是通过产生对茶多酚有降解作用的酶,从而使茶多酚的稳定性降低；EGCG可能是含酯基,且酚羟基较多,稳定性比ECG和EC差。2.茶多酚的给药浓度最好控制在0.25 mg/ml以内,以确保Caco-2细胞的存活率大于50%,配药溶剂和样品对Caco-2细胞均无影响,可排除待测溶液通过破坏Caco-2细胞单层的完整性,使EGCG的表观渗透系数偏大的可能；茶多酚的主要成分EGCG的RPapp＞2,说明EGCG可能受外排转运体的转运作用。加入P-gp的抑制剂维拉帕米后外排率显著下降,说明EGCG可能是P-gp的底物。3.罗丹明外排实验表明Caco-2细胞的P-gp功能完好；荧光定量PCR实验说明茶多酚对MDR1的表达具有浓度依赖性及时间依赖性抑制作用。4.WB实验说明茶多酚对P-gp和NF-κB的表达具有浓度依赖性及时间依赖性抑制作用,茶多酚有可能是通过下调NF-κB的表达,使NF-κB不能激活连接在MDR1启动子的报告基因的转录,导致P-gp表达量减少,底物外排减少。