论文部分内容阅读
目的:为探明苦龙胆酯苷(amarogentin)是否对肝癌细胞有抑制作用,以及抑制作用的机制如何?本课题研究了苦龙胆酯苷对HepG2和SMMC~7721肝癌细胞系增殖、凋亡和迁移的影响;苦龙胆酯苷对裸鼠p53相关细胞凋亡信号通路的影响,探索了苦龙胆酯苷诱导肝癌细胞凋亡的分子机制,为研究苦龙胆酯苷的药理作用奠定了基础。方法:采用乙醇法正丁醇部位萃取苦龙胆酯苷成分。分别用梯度浓度的苦龙胆酯苷作用于人正常肝细胞(LO2)和人肝癌细胞(HepG2和SMMC~7721)后,利用细胞计数试剂盒检测三种细胞在12、24和48小时的增殖情况;利用异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白/碘化丙啶,结合流式细胞仪检测苦龙胆酯苷成分在作用这三种细胞48小时后的凋亡率;利用Transwell法检测HepG2和SMMC~7721人肝癌细胞的迁移情况。在细胞水平和裸鼠肝癌模型中同时观察苦龙胆酯苷对p53相关细胞凋亡信号通路的影响,利用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime PCR)和蛋白质印记法(western blot)分别检测人肝癌细胞p53、AKt、NF~κB、hTERT和p38的mRNA和蛋白表达水平。结果:我们用改良过的提取方法,从獐芽菜提取物中获得苦龙胆酯苷粉末,其苦龙胆酯苷的获得率为18.33±1.20%,用高压液相仪检测最终纯化的苦龙胆酯苷,其纯度大于99.21%。通过体外细胞实验发现苦龙胆酯苷能够有效地抑制HepG2和SMMC~7721的增殖,并存在时间和剂量依赖性。当苦龙胆酯苷浓度达到110μg/mL,作用于肝癌细胞48小时后,不仅能够抑制人肝癌细胞的迁移,而且对人肝癌细胞的凋亡有促进作用。其中,p53的mRNA和蛋白表达明显增高,同时Akt、NF~κB和hTERT的mRNA和蛋白表达明显被抑制,和裸鼠肝癌模型组织中观察到的结果一致,而p38的mRNA和蛋白水平均无明显变化(P<0.05),差异具有统计学意义。说明苦龙胆酯苷通过p53凋亡相关信号通路促进肝癌细胞的凋亡,且与p38途径无关。结论:苦龙胆酯苷上调了肝癌细胞p53的mRNA和蛋白质表达,下调了hTERT、Akt、NF~κB亚基RelA(P65)的mRNA和蛋白质表达水平,促进了肝癌细胞的凋亡,对肝癌模型的治疗有一定的效果,为临床辅助治疗肝癌提供了新的思路。