研究背景及研究目的牙周炎是口腔临床医生日常接诊最常面临的疾病之一,慢性炎症持续性破坏牙槽骨,不仅导致牙齿松动、脱落,同时与许多全身性疾病相关。骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其自身具有的自我更新能力和多向分化能力受到研究者广泛关注,兼有取材方便、来源广泛的优势,同时由于来源于相对封闭的环境,不容易被常见的病理性因素破坏其生物学功能,是治疗前景比较理想的种子细胞。干细胞具有的骨向分化潜能是骨形成的重要细胞学基础,这使牙周组织再生成为了可能。然而现实中炎症的持续作用抑制着间充质干细胞的成骨分化,进而影响新骨形成。世界性的健康难题之一就是骨缺损的临床治疗,当前阶段的治疗效果仍然不甚理想。不仅仅是临床中常见的由于创伤引起的骨缺损,与机体老化、慢性炎症、免疫系统紊乱、全身系统性疾病等相关的骨病疾患,如风湿性骨病、骨密度降低、骨钙流失和牙周炎导致的牙齿缺失等等,都需要有效的骨再生修复能够应用于临床治疗。因此,探求炎症状态下的骨髓间充质细胞成骨机制以及改善其生物学性能是实现口腔医学中牙周组织再生的关键因素之一。干细胞的自我更新和分化是在特定的微环境下进行的。在微环境中,如果信号通路的组成部分发生失衡,就会导致干细胞自我更新和分化的障碍,从而引起疾病的发生。在多种退行性疾病发生发展过程中,往往存在着免疫的变化和异常炎症因素,而内源性干细胞引导的组织再生能够被过度炎症因素的存在所阻碍。作为影响干细胞巢稳态的重要因素之一,炎症反应能够显著的改变生物机体的内环境稳定,影响多种干细胞的生物学功能,其中包括间充质干细胞以及相邻细胞的生物学功能,继而在多种组织器官的再生修复中发挥负性调控作用。而急性炎症是机体对组织损伤做出的适应性反应之一,能够促进损伤的修复。当正常组织受损时,活化的干细胞可以在组织修复中发挥重要作用,但事实上干细胞所起到的作用很容易被忽略。急性炎症反应其实是典型的体液免疫反应过程,例如有实验模拟骨折愈合的过程,肿瘤坏死因子alpha（TNF-α）作为炎症反应重要的细胞因子之一,达到峰值高峰的时间点一般在骨折后24 h。TNF-α短时间的刺激脂肪来源的间充质干细胞,骨折附近高浓度的TNF-α能够募集动员更多的干细胞参与到组织的损伤修复,进而增强了间充质干细胞的成骨能力。与急性炎症反应相比较,慢性炎症往往破坏局部组织的重建和防御,不同来源的骨髓间充质干细胞（MSCs）的生物学行为均能受到TNF-α的影响。如牙周膜等组织来源的MSCs的多向分化能力会被TNF-α抑制,加剧牙周炎症导致的牙槽骨缺损;TNF-α能够造成牙龈组织来源的MSCs的病理性增殖,引起炎症性的牙龈增生。Wnt信号通路在骨组织再生方面发挥重要作用。一般Wnt信号通路主要指的是由β-catenin介导的经典信号通路,β-catenin是检测Wnt信号通路是否激活的一种关键标记物。有关研究成果表明,在激活Wnt/β-catenin后,可以使炎症环境下BMSCs的成骨分化潜能得到有效的激发。曾有研究人员针对干细胞的成骨分化能力进行了实验,根据实验结论,在进行分化时糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）通过不同的途径参与了调控。如GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路的负性调控因子,通过抑制Wnt/β-catenin信号通路参与了成骨细胞系和骨髓间充质干细胞的成骨向分化;在骨髓间充质干细胞的成软骨向分化过程中,GSK-3β通过调控NF-κB信号通路对骨髓间充质干细胞的成软骨向分化产生影响。研究表明,通过对GSK-3β表达的抑制,可以对具有多向分化潜能的间充质细胞分化为成骨细胞起到促进作用。沉默GSK-3β或者磷酸化失活GSK-3β会减少β-catenin降解而使其浓度增高,稳定表达的β-catenin入细胞核激活靶基因,促进了骨髓间充质干细胞的成骨向分化。因此,想要理解机体如何逆转病理性损伤实现组织的修复和再生,就需要深入研究干细胞与炎症之间错综复杂的相互联系。研究人员在针对真核生物进行研究时发现miRNAs可以发挥生物功能调控的作用,其属于内源性单链非编码核糖核酸。较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工产生相对较为成熟的微小核糖核酸,接下来会加入到组装沉默复合体的过程中,通过碱基互补配对对靶基因的信使核糖核酸进行识别,并根据互补程度的不同降解靶基因或者阻遏靶基因的翻译。细胞的多种生理病理过程都与miRNA密切相关,是近年来靶基因治疗领域的研究热点。目前认为,间充质干细胞的成骨分化受到miRNA的调控。很早以前,学者在针对如何抑制癌症问题进行思考时即针对miR-34a进行了大量的研究,随着有关研究的推进,学者们发现miR-34a不但能够对癌细胞的增殖以及迁移能产生重要的抑制作用,而且还能够对骨转移起到良好的抑制效果。近年来出现了大量与miR-34a相关的报道,根据学者们的研究成果,其在骨代谢方面可以发挥重要的作用,属于治疗骨疾病方面的一类重要微小核糖核酸。miR-34a能够对破骨细胞起到显著的抑制作用,同时还能够调节各种成骨活动,而且近年来一些研究报道指出,其在牙齿发育、软骨发育以及炎症反应等方面也起到了重要的作用。生理状态下的骨代谢过程不仅有miR-34a的参与,其同样可以调控病理情况下成骨细胞的生物学行为。miR-34a通过多条骨代谢相关的信号通路发挥调控作用,如受到广泛研究的MAPK以及Wnt/β-catenin等信号通路。然而,炎症微环境下miR-34a-5p对BMSCs具体生物学行为影响的研究开展相对较晚。长链非编码 RNA（Long none nodding RNAs,LncRNAs）作为 RNA 聚合酶Ⅱ转录的副产物,一度被认为是不具有生物学功能的“暗物质”。然而,有文献研究表明,在细胞内转录比例更高的LncRNA能够参与许多生命过程,是细胞内不能忽略的、重要的功能调控因子,具有更加复杂而重要的生物学功能。LncRNA与众多的生理病理过程密切相关,在炎症反应方面尤其显著。已有文献证实在正常以及疾病条件下,MSCs的成骨分化LncRNA均有参与。同时也有研究报道证实,影响核富集转录体 1（nuclear enriched abundant transcript1,NEAT1）的表达可以进一步引起牙周组织的炎性损伤。炎症微环境下,BMSCs会出现新的LncRNA,同时会有大量差异表达的LncRNA存在,这些LncRNA影响间充质干细胞的发育和分化。其中的一些LncRNA能够发挥ceRNA（competing endogenous RNAs,竞争性内源RNA）的作用与miRNA组成调控网络,从而调控靶基因的蛋白编码。本研究预先通过生物信息学分析发现LncRNA-NEAT1与miR34a-5p部分碱基互补,由此推测LncRNA-NEAT1可能通过海绵作用调控miR-34a-5p。本实验第三部分证实了 GSK-3β是miR-34a-5p的靶基因,因此后续研究推测NEAT1（LncRNA）/miR-34a-5p/GSK-3β轴有可能对骨髓间充质干细胞的成骨分化产生影响。通过NEAT1与miR-34a-5p的过表达或沉默表达,探讨二者对间充质干细胞成骨分化的调控机制。根据以上,我们拟检测miR-34a-5p在炎症微环境下骨改建过程中的改变,同时研究分析了炎症环境下miR-34a-5p对于机体骨改建的影响与可能的影响机制。研究方法1.分离rBMSCs,并进行培养,分别进行成脂分化与成骨分化诱导实验,检测间充质干细胞表面标记物CD90、CD44和CD29及造血干细胞表面标志物CD34和CD45的表达。2.检测miR-34a-5p对TNF-α诱导的rBMSCs成骨抑制的逆转作用。使用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和Western blot检测TNF-α诱导及miR-34a-5p干预后Runt相关转录因子2（Runx2）、成骨细胞特异性转录因子（OSX）的表达,碱性磷酸酶（ALP）染色和活性检测、茜素红染色和定量分析矿化结节的情况。3.miR-34a-5p/GSK-3β轴对TNF-α诱导下rBMSCs成骨向分化影响的研究。在炎症环境下,同时对目标miRNA进行了上调和抑制,之后检测了与Wnt/β-catenin通路有关的蛋白。通过荧光素酶报告基因检测对miR-34a-5p的靶基因GSK-3β进行验证。利用茜素红染色和定量分析、Western blot检测沉默GSK-3β后rBMSCs的成骨分化能力。4.LncRNA-NEAT1通过miR-34a-5p/GSK-3β轴影响炎症微环境下rBMSCs成骨分化的初步研究。下调miR-34a-5p后通过qPCR观察LncRNA-NEAT1的表达水平,以及下调LncRNA-NEAT1后观察miR-34a-5p的表达水平;荧光素酶报告基因验证LncRNA-NEAT1与miR-34a-5p之间的相互作用。利用qPCR,Western blot,ALP染色和茜素红染色检测LncRNA-NEAT1对炎症微环境下rBMSCs成骨分化的调控作用;上调或下调LncRNA-NEAT1后,通过qPCR和Western blot观察GSK-3β的表达水平。结果1.细胞经过常规体外培养后酶消化法传代,细胞状态良好,生长迅速,成骨成脂诱导成功。干细胞流式细胞术检测到间充质干细胞表面标记物CD90、CD44和CD29阳性表达,造血干细胞表面标志物CD34和CD45阴性表达。2.TNF-α介导成骨的炎症微环境条件下,rBMSCs成骨分化能力明显受到抑制。上调miR-34a-5p的表达后,能够促进成骨相关基因Runx2和Osterix的表达,增强了 ALP活性和茜素红的染色。下调miR-34a-5p表达后成骨相关基因Runx2和Osterix的表达受到抑制,ALP活性和茜素红染色减弱。3.TNF-α通过NF-κB通路抑制了 miR-34a-5p的表达。利用生物信息学分析,通过获得/缺失性功能试验、荧光素酶报告基因检测证实了 miR-34a-5p能够结合于GSK-3β mRNA 3’UTR来抑制其表达。miR-34a-5p可通过对靶基因的GSK-3β抑制来激活Wnt/β-catenin信号通路。4.生物信息学分析结合荧光素酶报告基因证实LncRNA-NEAT1与miR-34a-5p形成相互抑制表达的闭合环。LncRNA-NEAT1可以负向调控GSK-3β的表达。在TNF-α诱导下,通过抑制LncRNA-NEAT1可以增强成骨相关基因的表达,促进ALP活性,进而能够使干细胞形成更多的骨结节;反之,LncRNA-NEAT1的上调会降低成骨相关基因的表达,抑制ALP活性和骨结节形成能力。结论1.在rBMSCs的成骨向分化过程中,TNF-α可通过影响特定的miRNA表达来发挥抑制作用。TNF-α对rBMSCs成骨分化的抑制作用可以通过上调miR-34a-5p的表达来进行拮抗,并且能够显著恢复炎症微环境下rBMSCs的成骨分化能力,提示在炎症条件下rBMSCs成骨的发生发展中,miRNA介导的转录后调控具有重要作用。2.miR-34a-5p通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进TNF-α刺激下的rBMSCs的成骨分化,显著改善TNF-α造成的rBMSCs成骨分化能力下降。LncRNA-NEAT1与miR-34a-5p形成负向调控的闭合环路,两者均可以通过调控GSK-3β的表达影响rBMSCs的成骨分化能力。