缺氮及氮恢复对龙须菜内源氨氮代谢影响的研究

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氨氮是海藻最容易被吸收和利用的氮源形式,氨氮被藻体吸收后,形成含氮有机物,之后可通过联合脱氨、光呼吸等作用脱去氨基产生内源氨氮,硝酸还原酶还原硝氮也可以产生内源氨氮。内源氨氮在藻体中参与氮代谢,在外源氨氮供给不稳定的情况下,内源氨氮的代谢水平与藻体的生理生化反应密切相关,而在外源氮供给缺乏的条件下藻体内源氨氮和光呼吸等生理代谢之间的关系的研究却少见报道。因此,本文以龙须菜为实验材料,施以缺氮和氮恢复的培养条件,通过检测光合色素,氨基酸等基础生理生化指标和氮代谢相关基因的表达量来探讨缺氮条件下及氮恢复后光呼吸与藻体内源氨氮的关系,并探讨在缺氮条件下及氮恢复后光合作用和光呼吸作用之间的相互影响。  本文以龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)为实验材料,取20g龙须菜以氮营养浓度为90μM(其中氨氮与硝氮的摩尔比为NH4+:NO3-=2:1)、磷营养浓度为4.48μM的人工海水预培养10d。经预培养后的龙须菜先进行缺氮处理10d,然后再氮恢复处理4d,对照组氮浓度与预培养的浓度保持一致。实验期间每两天换一次水,分别在缺氮处理的0h、4h、8h、24h、48h、4d、10d和补氮后的4h、8h、24h、48h、4d时间点取龙须菜用于后续指标的测定。本文测定了谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等氨基酸、叶绿素a、可溶性糖、藻红蛋白、可溶性蛋白、藻体内的氨氮等的含量的变化,并且检测了光呼吸关键酶基因甘氨酸脱羧酶T亚基(GDCT)、甘氨酸脱羧酶P亚基(GDCP)、丝氨酸:乙醛酸转氨酶(SGAT)、羟甲基丝氨酸转移酶(SHMT)、羟基丙酮酸还原酶(HPR),光合作用关键酶基因景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBP)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RUB),以及氮代谢相关酶基因天冬酰胺合成酶(AS)、谷氨酰胺合成酶(GS)、硝酸还原酶(NR)、丙酮酸脱氢酶(PDH)和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)相对表达量的变化。  实验结果表明:缺氮组中谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等主要氨基酸、可溶性蛋白和藻红蛋白等含氮有机物即氮库组成成分的含量在缺氮培养4-10d显著降低,说明长时缺氮(4-10d)会造成氮库的降解。藻体内源氨氮含量在缺氮培养第10d与对照组相比显著增加(P<0.05),这可能与氮库的降解有关。缺氮组光呼吸关键酶基因甘氨酸脱羧酶 T亚基(GDCT)、甘氨酸脱羧酶P亚基(GDCP)和羟基丙酮酸还原酶(HPR)的表达量在缺氮培养0-48h与对照组相比稍有增加,说明缺氮处理会使光呼吸适当增强。已知光呼吸过程会产生大量的内源氨氮,因此增强的光呼吸会产生更多的内源氨氮,使得缺氮组的内源氨氮含量高于对照组。谷氨酰胺合成酶(GS)在同化氨氮方面发挥着重要作用,本研究所检测的GS的表达量在缺氮第10d与对照组相比显著增加(p<0.05),与藻体内源氨氮含量增加时间一致,因此推测GS能同化内源氨氮。即藻体中内源氨氮的同化途径与外源氨氮的同化途径相同。恢复氮源培养后,氮恢复组龙须菜藻体中氨基酸、可溶性蛋白和藻红蛋白的含量逐渐增,但是氮恢复组藻体内源氨氮的含量仍保持较高水平,仍显著高于对照组。这可能是因为氨基酸、可溶性蛋白和藻红蛋白的合成在消耗内源氨氮的同时也会有内源氨氮的产生。相比对照组,氮恢复组天冬酰胺合成酶(AS)和GS表达量显著上调(p<0.05),能够催化合成更多的天冬酰胺和谷氨酰胺,从而合成其他氨基酸与蛋白质等物质。光呼吸关键酶基因GDCT、GDCP、丝氨酸:乙醛酸转氨酶(SGAT)和 HPR的表达量在氮恢复后都显著高于对照组,这可能是氮恢复组藻体中内源氨氮含量仍保持较高水平的原因。缺氮后再恢复氮源,氮恢复组AS、GS和硝酸还原酶(NR)的表达量与对照组相比都显著增加(p<0.05),进一步提升龙须菜对氨氮和硝氮的吸收,这从基因表达层面反映了龙须菜超补偿吸收现象。  缺氮组藻体中光合色素叶绿素a和藻红蛋白的含量在4-10d显著降低,光合作用的关键酶基因核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RUB)的表达量在4-10d也低于对照组,说明长时(4-10d)缺氮会使光合作用变弱。与之相应,缺氮组的光呼吸也由强变弱,这可能是因为光呼吸依赖于光合作用产生的能量减少造成的。氮恢复组藻体中叶绿素a和藻红蛋白的含量逐渐增加,但仍低于对照组,藻体中RUB和另一光合作用关键酶基因景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(SBP)的表达量都显著高于对照组,且随时间变化呈逐渐增加的趋势。说明氮恢复会使光合作用显著增强,但光合作用强度与叶绿素a和藻红蛋白的含量之间并不呈正相关关系,这可能是因为无论在缺氮处理还是氮恢复处理条件下,龙须菜最大光量子产量(Fv/Fm)的比值都不受影响,仍保持着最大的潜在光合转换效率。氮恢复组中藻体光合作用增强的同时光呼吸也增强,这可能是因为光合作用增强会产生很多的能量,而能量过多的话会使龙须菜产生光抑制,因此需要增强光呼吸来消耗掉过多的能量。  缺氮处理后,龙须菜藻体中呼吸作用关键酶基因丙酮酸脱氢酶(PDH)的表达量与对照组相比下调,说明呼吸作用减弱,从而减少对可溶性糖的消耗。本研究结果中缺氮组藻体中可溶性糖的含量相比对照组显著增加(p<0.05),这可能与呼吸作用变弱和氮库物质的降解有关。恢复氮供给后,氮恢复组藻体中可溶性糖含量仍高于对照组,且琼胶合成相关基因UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)的表达量与对照组相比显著增加(p<0.05),意味着琼胶合成增加。此结果反映了缺氮培养后再恢复氮源龙须菜可产生超补偿生长作用,这可为重要的产琼胶海藻龙须菜的养殖生产提供参考。
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