第一章自发性高血压大鼠中profilin-1的表达。　　 研究目的：　　 Profilin-1是一种小分子量的肌动蛋白结合蛋白，广泛存在于除骨骼肌之外的机体组织，可调节肌动蛋白聚合及解聚过程；参与调节细胞的增殖、分化和运动过程以及信号转导。许多研究显示，profilin-1在冠心病、高血压、糖尿病等心血管疾病的发生中起重要作用。有研究显示过表达profilin-1的FVB/N小鼠主动脉profilin-1蛋白水平增加，主动脉血管壁出现明显的肥厚征兆，且profilin-1过表达小鼠从出生后6个月开始收缩压和平均动脉压显著增高。　　 方法：　　 选取12周龄雄性自发高血压大鼠24只，随机分为三组，即SHR组，低剂量氯沙坦组(Los(L))及高剂量氯沙坦组(Los(H))每组8只；以性别、周龄匹配的WKY(Wistar Kyoto rats)大鼠8只作为对照。其中Los(L)组给予15mg/kg/d的氯沙坦灌胃，Los(H)组给予30mg/kg/d的氯沙坦灌胃，SHR组及WKY组给予等体积的生理盐水灌胃，常规喂养至20周后终止实验。开始及每周测量大鼠尾动脉压。实验结束后，抽血分离血浆检测血管紧张素Ⅱ(AngiotensionⅡ，AngⅡ)，麻醉后取胸主动脉及肠系膜三级动脉，行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色。利用计算机辅助成像系统测算动脉中层厚度(media thickness，MT)，管腔直径(lumen diameter，LD)，厚度/腔径(MT/MD)，动脉中膜细胞平均核面积，免疫组织化学染色检测profilin-1抗原在动脉壁的表达。提取胸主动脉mRNA及蛋白，采用Real-Time PCR及Western-Blot方法测量大鼠胸主动脉profilin-1 mRNA及蛋白的表达。　　 结果：　　 1、SHR组收缩期血压(systolic blood pressure，SBP)明显高于WKY组(P<0.01)，Los(L)组及Los(H)组SBP较同期SHR者明显降低，且Los(H)组SBP降低幅度更大(P<0.01)。　　 2、处理结束后检测SHR大鼠血浆AngⅡ水平明显高于WKY组(P<0.01)，Los(L)组及Los(H)组，AngⅡ较SHR组明显升高，且Los(H)组升高幅度更大(P<0.01)。　　 3、HE染色显示SHR组胸主动脉及肠系膜动脉重构明显，Los(L)组及Los(H)组结果显示氯沙坦可部分防止高血压的血管重构。SHR组肠系膜动脉MT、LD、MT/LD及中膜血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)平均核面积较WKY组大鼠显著增大，Los(L)组及Los(H)组结果显示氯沙坦可部分预防重构发生。　　 4、SHR胸主动脉及肠系膜动脉profilin-1染色明显高于WKY组，Los(L)组及Los(H)组结果显示氯沙坦可降低SHR动脉profilin-1的表达。　　 5、SHR胸主动脉profilin-1 mRNA及蛋白表达明显高于WKY大鼠(P<0.05)，Los(L)组及Los(H)组profilin-1 mRNA表达介于SHR组与WKY组之间。　　 结论：　　 SHR大鼠胸主动脉及肠系膜动脉profilin-1表达明显增加，氯沙坦治疗可降低profilin-1表达。　　 第二章 AngⅡ干预平滑肌细胞后profilin-1表达变化。　　 研究目的：　　 在高血压发病过程中血管重构是其重要特征，包括内皮功能失调，血管平滑肌细胞增生，血管内径明显减少，中膜横截面积增加，平均细胞核面积增加等。　　 血管紧张素Ⅱ在正常情况下对维持血压有良好的作用，但是在病理情况下，产生过多时会引起血压升高及心脏及血管重构，从而导致靶器官的损害。　　 本文第一章研究提示在SHR中，可见血浆AngⅡ水平明显升高，胸主动脉及肠系膜动脉存在明显的血管重构及profilin-1表达增加，氯沙坦处理可部分抑制血管重构及profilin-1的增加。　　 本章采用外源性AngⅡ干预大鼠血管平滑肌细胞株(rat vascularsmooth muscle cells，RVSMC)，观察RVSMC细胞增殖情况及profilin-1的表达情况，并采用氯沙坦干预观察其对RVSMC细胞增殖情况及profilin-1表达的影响，以进一步明确profilin-1在平滑肌细胞增殖中是否起作用。　　 方法：　　 培养大鼠血管平滑肌细胞株，分别用不同浓度(0，10-8M，10-7M，10-6M)AngⅡ处理不同时间(6h，12h，18h，24h)，采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况；采用Western-Blot法检测大鼠血管平滑肌细胞profilin-1蛋白的表达。低剂量(10-6M)及高剂量(10-5M)氯沙坦预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后给予AngⅡ终浓度10-6M处理24h，采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况；采用Western-Blot法检测大鼠血管平滑肌细胞profilin-1蛋白的表达。　　 结果：　　 1、AngⅡ可呈浓度及剂量依赖性的促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖，以10-6MAngⅡ处理大鼠血管平滑肌细胞24h后最为显著。　　 2、氯沙坦预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后，加入10-6M AngⅡ继续处理细胞24h后，可见大鼠平滑肌细胞增殖能力明显下降。　　 3、AngⅡ可呈浓度及剂量依赖性的上调大鼠血管平滑肌细胞profilin-1的表达，以10-6M AngⅡ处理大鼠血管平滑肌细胞24h后最为显著。　　 4、氯沙坦预处理大鼠血管平滑肌细胞1h后，加入10-6M AngⅡ继续处理细胞24h后，可见氯沙坦可显著抑制AngⅡ诱导的profilin-1蛋白的表达。　　 结论：　　 AngⅡ可呈浓度及剂量依赖性的上调大鼠血管平滑肌细胞profilin-1的表达，氯沙坦预处理可显著抑制AngⅡ诱导的profilin-1蛋白的表达。　　 第三章沉默profilin-1基因后AngⅡ处理平滑肌细胞后功能变化：　　 研究目的：　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由外源或内源性的双链RNA(double strand RNA，dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解，进而抑制相应的基因表达。本章采用RNA干扰技术将大鼠血管平滑肌细胞内profilin-1基因沉默后，观察AngⅡ对新的细胞系增殖功能的影响，进一步明确profilin-1在大鼠血管平滑肌细胞增殖中的作用，进而为研究高血压血管霞构的机制提供新的思路。　　 JAK/STAT信号转导途径是一种压力反应性途径，一般情况信号通过细胞表面受体传入细胞核，进而调节基因表达。有研究显示AngⅡ可通过结合AngⅡ受体而激活JAK家族中的JAK2和TYK2，进而使STAT蛋白的磷酸化水平增强(STAT1α/h，STAT2 and STAT3)。另有研究指出JAK2在AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖中期关键作用。本章研究了阻断JAK2/STAT3途径对AngⅡ诱导的平滑肌细胞增殖的影响及对profilin-1表达的影响，初步探讨profilin-1影响血管平滑肌细胞增殖的机制。　　 方法：　　 培养大鼠血管平滑肌细胞株，并由上海吉凯基因化学技术有限公司合成profilin-1 siRNA质粒，采用FuGENE HD转染试剂将profilin-1siRNA质粒成功转染大鼠血管平滑肌细胞株，采用Real-Time PCR及Western-Blot法检测profilin-1基因沉默效果；AngⅡ以终浓度10-6M处理该细胞系，采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况。JAK2/STAT3信号转导途径抑制剂预处理正常大鼠血管平滑肌细胞株1h后给予AngⅡ终浓度10-6M处理24h，采用MTT法及流式细胞仪测定细胞周期法观察大鼠血管平滑肌细胞的增殖情况；采用Western-Blot法检测大鼠血管平滑肌细胞profilin-1蛋白的表达。　　 结果：　　 1、利用FuGENE HD转染试剂成功建立了profilin-1基因沉默的大鼠血管平滑肌细胞株，其profilin-1基因表达明显下调。　　 2、沉默profilin-1基因后，AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖能力下降。　　 3、采用JAK/STAT3抑制剂阻断JAK/STAT3信号转导途径后，AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖的能力下降。　　 4、采用JAK/STAT3抑制剂阻断JAK/STAT3信号转导途径后，AngⅡ处理平滑肌细胞后profilin-1蛋白表达下降。　　 结论：　　 Profilin-1基因沉默后AngⅡ诱导平滑肌细胞增殖能力下降，AngⅡ致血管重构作用部分通过AT1/JAK2/STAT3途径上调profilin-1表达而实现的。