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目的:
本研究通过建立慢性砷暴露小鼠学习记忆损伤模型和小胶质细胞体外砷染毒模型,观察慢性砷暴露小鼠学习记忆能力是否受损、小鼠脑内小胶质细胞是否活化,并基于细胞代谢组学探讨小胶质细胞有机砷和无机砷染毒对代谢组的影响。
方法:
40只健康3周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠,随机分为对照组和砷暴露组,每组20只。对照组饮用自来水,砷暴露组小鼠饮用自来水配制而成的50 mg/L亚砷酸钠溶液。40只小鼠连续自由饮水染毒24周后,采用Morris水迷宫测定小鼠学习记忆能力的变化;采用 HE染色,尼氏染色观察小鼠海马和皮层神经元损伤情况;透射电镜观察慢性砷暴露后小鼠脑内超微结构的病理变化;多重免疫荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜技术观察慢性砷暴露后小鼠海马、皮层小胶质细胞活化标志物CD86及CD206的表达;ELISA实验检测脑内细胞因子IL-1β,TNF-α,IL-10和TGF-β表达验证小胶质细胞活化的分型。体外实验采用CCK-8 实验检测 iAs,DMA和MMA对小胶质细胞活性的影响;流式细胞实验检测不同砷处理后小胶质细胞的细胞周期、细胞凋亡和细胞分型;非靶向 GC-MS 技术分析有机砷与无机砷染毒小胶质细胞的差异性代谢产物,生物信息学方法分析相关代谢通路。
结果:
砷暴露组小鼠体重和脑脏器系数与对照组相比差异无统计学意义(P> 0.05)。砷暴露组小鼠潜伏期长于与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。砷暴露组小鼠目标象限停留时间少于对照组小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色和尼氏染色结果显示对照组小鼠海马、皮层结构正常、排列整齐、神经元均匀分布、尼氏小体清晰可见,而砷暴露组小鼠海马 DG 区和皮层空泡增多、排列稀疏、核固缩、神经元呈不规则排列、部分尼氏小体消失。相比对照组海马和皮层超微结构,砷暴露组神经元胞体皱缩变小,形态不规则,细胞器见显著水肿,空泡,线粒体见明显肿胀、脊减少或无脊、空泡样改变,粗面内质网RER扩张。砷暴露组海马突触后膜与对照组相比变薄(P< 0.05),而砷暴露组皮层突触后膜与对照组相比增厚(P< 0.05)。砷暴露小鼠CD86+CD206—,CD86—CD206+,CD86+CD206+细胞较对照组相比显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示砷暴露组小鼠脑内 IL-1β,TNF-α 含量明显高于对照组,IL-10 含量明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P< 0.05)。砷暴露组小鼠和对照组小鼠脑内TGF-β含量差异无统计学意义(P> 0.05)。体外实验根据CCK-8实验结果选择细胞染毒浓度为iAs 0.6μM,MMA 0.1μM,DMA600μM。流式细胞结果显示不同砷处理对小胶质细胞的细胞周期和细胞凋亡影响不同,处理后超过50%的小胶质细胞呈CD86+CD206—。PCA结果显示不同种类砷对小胶质细胞处理后细胞代谢物存在显著差异,差异具有统计学意义(P< 0.05)。DMA处理组中仅发现天门冬酰胺、半胱氨酸、β-丙氨酸和反式-4-羟脯氨酸4种代谢物与对照组相比存在显著差异。MMA 处理组中差异性代谢物显著降低,包括有柠檬酸、鸟氨酸、去亮氨酸、色氨酸、组氨酸、二甲基氨基丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脱氢抗坏血酸、癸酸(C10_0)和l-丙氨酸、n-甲氧基羰基-丙酯。iAs处理组中代谢产物花生四烯酸的浓度较低,与总砷处理组相比差异性代谢物有2-羟基谷氨酸、顺式疫苗酸(C18_1n-7c)、十四酸、12-甲基-甲酯(S)。对比iAs处理组,总砷处理组有5种差异性代谢物(柠檬酸;2-Aminoadipicacid;3,5-Diiodo-L-tyrosine;3-Pentenoic acid;2,2-二甲基-;4羟基苯磺酸)。未观察到DMA处理后小胶质细胞的差异性代谢通路。MMA可引起氨基酸、TCA循环中间产物、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的代谢改变。无机砷处理小胶质细胞后差异性代谢通路有组氨酸代谢,精氨酸的生物合成、磷酸戊糖途径等。
结论:
慢性砷暴露可损伤小鼠空间学习和记忆能力。慢性砷暴露后小鼠脑内小胶质细胞活化介导的神经炎症可能为慢性砷暴露导致的小鼠学习和记忆能力受损的作用机制之一。MMA处理后小胶质细胞主要呈促炎作用,可能是急性砷暴露诱导细胞损伤和炎症的潜在靶点。无机砷处理后主要影响小胶质细胞的能量代谢,当有机砷和无机砷在小胶质细胞中共同作用时产生的差异性代谢通路有助于理解慢性砷暴露致神经毒性的机理。
本研究通过建立慢性砷暴露小鼠学习记忆损伤模型和小胶质细胞体外砷染毒模型,观察慢性砷暴露小鼠学习记忆能力是否受损、小鼠脑内小胶质细胞是否活化,并基于细胞代谢组学探讨小胶质细胞有机砷和无机砷染毒对代谢组的影响。
方法:
40只健康3周龄清洁级C57BL/6J雄性小鼠,随机分为对照组和砷暴露组,每组20只。对照组饮用自来水,砷暴露组小鼠饮用自来水配制而成的50 mg/L亚砷酸钠溶液。40只小鼠连续自由饮水染毒24周后,采用Morris水迷宫测定小鼠学习记忆能力的变化;采用 HE染色,尼氏染色观察小鼠海马和皮层神经元损伤情况;透射电镜观察慢性砷暴露后小鼠脑内超微结构的病理变化;多重免疫荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜技术观察慢性砷暴露后小鼠海马、皮层小胶质细胞活化标志物CD86及CD206的表达;ELISA实验检测脑内细胞因子IL-1β,TNF-α,IL-10和TGF-β表达验证小胶质细胞活化的分型。体外实验采用CCK-8 实验检测 iAs,DMA和MMA对小胶质细胞活性的影响;流式细胞实验检测不同砷处理后小胶质细胞的细胞周期、细胞凋亡和细胞分型;非靶向 GC-MS 技术分析有机砷与无机砷染毒小胶质细胞的差异性代谢产物,生物信息学方法分析相关代谢通路。
结果:
砷暴露组小鼠体重和脑脏器系数与对照组相比差异无统计学意义(P> 0.05)。砷暴露组小鼠潜伏期长于与对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。砷暴露组小鼠目标象限停留时间少于对照组小鼠,差异具有统计学意义(P<0.05)。HE染色和尼氏染色结果显示对照组小鼠海马、皮层结构正常、排列整齐、神经元均匀分布、尼氏小体清晰可见,而砷暴露组小鼠海马 DG 区和皮层空泡增多、排列稀疏、核固缩、神经元呈不规则排列、部分尼氏小体消失。相比对照组海马和皮层超微结构,砷暴露组神经元胞体皱缩变小,形态不规则,细胞器见显著水肿,空泡,线粒体见明显肿胀、脊减少或无脊、空泡样改变,粗面内质网RER扩张。砷暴露组海马突触后膜与对照组相比变薄(P< 0.05),而砷暴露组皮层突触后膜与对照组相比增厚(P< 0.05)。砷暴露小鼠CD86+CD206—,CD86—CD206+,CD86+CD206+细胞较对照组相比显著增多,差异具有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示砷暴露组小鼠脑内 IL-1β,TNF-α 含量明显高于对照组,IL-10 含量明显低于对照组,差异均具有统计学意义(P< 0.05)。砷暴露组小鼠和对照组小鼠脑内TGF-β含量差异无统计学意义(P> 0.05)。体外实验根据CCK-8实验结果选择细胞染毒浓度为iAs 0.6μM,MMA 0.1μM,DMA600μM。流式细胞结果显示不同砷处理对小胶质细胞的细胞周期和细胞凋亡影响不同,处理后超过50%的小胶质细胞呈CD86+CD206—。PCA结果显示不同种类砷对小胶质细胞处理后细胞代谢物存在显著差异,差异具有统计学意义(P< 0.05)。DMA处理组中仅发现天门冬酰胺、半胱氨酸、β-丙氨酸和反式-4-羟脯氨酸4种代谢物与对照组相比存在显著差异。MMA 处理组中差异性代谢物显著降低,包括有柠檬酸、鸟氨酸、去亮氨酸、色氨酸、组氨酸、二甲基氨基丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脱氢抗坏血酸、癸酸(C10_0)和l-丙氨酸、n-甲氧基羰基-丙酯。iAs处理组中代谢产物花生四烯酸的浓度较低,与总砷处理组相比差异性代谢物有2-羟基谷氨酸、顺式疫苗酸(C18_1n-7c)、十四酸、12-甲基-甲酯(S)。对比iAs处理组,总砷处理组有5种差异性代谢物(柠檬酸;2-Aminoadipicacid;3,5-Diiodo-L-tyrosine;3-Pentenoic acid;2,2-二甲基-;4羟基苯磺酸)。未观察到DMA处理后小胶质细胞的差异性代谢通路。MMA可引起氨基酸、TCA循环中间产物、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的代谢改变。无机砷处理小胶质细胞后差异性代谢通路有组氨酸代谢,精氨酸的生物合成、磷酸戊糖途径等。
结论:
慢性砷暴露可损伤小鼠空间学习和记忆能力。慢性砷暴露后小鼠脑内小胶质细胞活化介导的神经炎症可能为慢性砷暴露导致的小鼠学习和记忆能力受损的作用机制之一。MMA处理后小胶质细胞主要呈促炎作用,可能是急性砷暴露诱导细胞损伤和炎症的潜在靶点。无机砷处理后主要影响小胶质细胞的能量代谢,当有机砷和无机砷在小胶质细胞中共同作用时产生的差异性代谢通路有助于理解慢性砷暴露致神经毒性的机理。