目的：应用C-erbB-2基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)联合重组改构人肿瘤坏死因子(Recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha，rmhTNF-α)作用于肺腺癌Calu-3细胞株，检测癌细胞株的凋亡情况，从而探讨siRNA敲除C-erb-2基因对rmhTNF-α仅诱导肺腺癌Calu-3细胞凋亡的影响，为临床上肺腺癌患者治疗的新途径提供实验的依据。 方法： 1. 肺腺癌Calu-3细胞株的复苏，常规培养：取本实验室冻存的细胞株，用10％灭活的胎牛血清的MEM/NEAA培养基，于37℃，5％CO2常规培养。 2. C-erbB-2基因小干扰RNA的设计：以C-erbB-2全基因序列作为模板，根据siRNA的设计原则和要求，进行计算机辅助设计，siRNA序列如下：上游序列 5’-GCUCUUUGAGGACAACUAU-3’，下游序列 5’-AUAGUUGUCCUC AAAGAGC-3’，序列经 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)检索证实与其它基因无同源性。由上海吉码制药公司设计三对siRNA及阴性、阳性对照，并给予合成。 3．转染效率的测定：将对数生长期的肺腺癌Calu-3细胞消化后，以5×105个/ml接种于六孔板上，按照转染荧光标记siRNA的浓度分为五组，分别是：40nM、60nM、80nM、100nM和120nM组，每组三个复孔。以每孔脂质体5 μ l，siRNA分别为4 μ l、6 μ l、8 μ l、10 μ l和12 μ l配成转染复合物。加入接种有Calu-3细胞的孔板中进行转染，转染后48小时荧光显微镜下观察绿色荧光，用Image-Pro Plus Version 6.0软件分析积分荧光光密度，以判断转染效率。 4．实时荧光定量PCR(fluorogenic-quantitative PCR，FQ-PCR)检测siRNA的干扰效果，筛选干扰效果最佳的siRNA：将对数生长期的肺腺癌Calu-3细胞消化后，以5×105个/ml每孔2ml接种于六孔板上，将细胞分为8组进行转染，分别为空白对照组、阴性对照组、GAPDH阳性对照组、脂质体组、554组、1309组、2621组和3882组(数字为合成四对针对C-erbB-2基因siRNA的代码)，每组设3个复孔。根据转染效率测定的结果，以转染效率最佳组别siRNA的浓度转染细胞，37℃，5％CO2培养箱48小时。然后用TRIzol试剂分别提取各组细胞总RNA，应用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检测所提取RNA样本的浓度、纯度以及完整性。以各组总RNA为模板，进行实时荧光定量PCR，用MyiQTM Optical Modμle的电脑软件分析系统分析实时荧光定量PCR反应结果，筛选干扰效果最好的siRNA。 5．rmhTNF-α工作浓度的筛选：在96孔板中，按rmhTNF-α浓度(OU/μl～400U/μl)分为5个组，每组设三个复孔。不同浓度的rmhTNF-α作用癌细胞48小时后，应用MTT方法检测每组的0D值，筛选出最佳rmhTNF-α浓度。6.C-erbB-2 siRNA对rmhTNF-α诱导肺腺癌Calu-3细胞株凋亡的检测： ①实验分组：将对数生长期的肺腺癌Calu-3细胞消化后，以5×105个/ml每孔2ml接种于六孔板上，分4组进行实验，分别是空白组、单纯siRNA组、rmhTNF-α组、siRNA加rmhTNF-α组，每组设3个复孔。将上述细胞移至37℃，5％CO2培养箱中培养48小时。 ②流式细胞仪检测Calu-3细胞的凋亡：消化收集上述4组细胞，按照Annexin V-FITC Kit凋亡试剂盒操作，用流式细胞仪检测细胞凋亡。7.数据经方差齐性检验后，进行单因素方差分析，由SPSS13.0软件统计包完成。P<0.05或者P<0.01均为显著性差异。 结果： 1.转染效率的检测，在siRNA转染浓度为40nM、60nM、80nM、100nM和120nM的五个试验组中，测得积分荧光光密度分别为62.842±1.553、82.611±1.429、93.725±2.851、106.863±0.771和107.558±4.482，不同浓度组之间转染效率的差异有统计学意义(P<0.01)，其中120nM组的转染效率最高。但100nM组的细胞活性好于120nM组，因此100nM组的转染效率最佳。 2.siRNA干扰Calu-3细胞后总RNA浓度及纯度的测定：总RNA样品经紫外分光光度计测定，浓度为0.5～2.0 μg/μ1，纯度OD260/OD280为1.7～2.0，符合逆转录要求。经2％琼脂糖凝胶电泳显示28S、18S和5S rRNA三条带，其中前两者更清晰，且28S的亮度是18S的2倍左右，表明提取总RNA样品可用作RT-PCR扩增模板。实时荧光定量PCR筛选干扰效果最佳的siRNA，实验结果分析显示，空白对照组、脂质体组、阴性对照组、554组、2621组、1309组和3882组Calu-3细胞中C-erbB-2 mRNA的相对表达量分别为1.005±0.124、1.010±0.101、0.890±0.095、0.110±0.065、0.0054±0.002、0.096±0.025、0.100±0.053，各干扰组与空白组、脂质体组、阴性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，各干扰组之间比较结果如下：2621组与554组、1309组和3882组之间两两比较差异有统计学意义(p<0.05)，554、1309和3882三组之间两两比较则均无显著性差异(p>0.05)。2621组为干扰效果最佳的siRNA。 3.rmhTNF-α工作浓度的筛选：实验分为：0U/μ l组50U/μ l组、100U/μ l组、200U/μ l组、400U/μl组，通过MTT法检测抑制率分别为0、14.56％±6.19％、16.32％±4.94％、27.20％±4.65％、29.68％±2.47％，各rmhTNF-α作用组与对照组比较，差异均具有统计学意义(p<0.05)，200U/μl与400U/μl组间差异无统计学意义(p>0.05)，所以200U/μl为最佳浓度组。 4.流式细胞仪检测凋亡：各组Calu-3细胞经siRNA干扰联合rmhTNF-α作用48小时后，凋亡率分别为：空白组7.767％±0.551％、干扰组14.400％±1.114％、rmhTNF-α组27.200％±1.650％、siRNA+rmhTNF-α组37.679％+1.349％，其中siRNA+rmhTNF-α组凋亡率最高，与其它各组比较差异有统计学意义(p<0.01)。 结论： 1.成功构建并筛选了一对针对Calu-3细胞C-erbB-2基因十分有效的siRNA，为以后针对C-erbB-2基因siRNA的研究奠定了实验基础。 2.C-erbB-2 siRNA能够促进Calu-3细胞凋亡。 3.靶向转染C-erbB-2基因siRNA的Calu-3细胞提高了对rmhTNF-α的敏感性。