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[目的]急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是由于急性持续性冠状动脉缺血缺氧引起的心肌坏死,最终导致心肌重构及难以逆转的心功能下降。目前,对于心肌梗死的治疗方法主要包括药物、溶栓治疗、介入及手术治疗等,但这些措施不能从根本上解决心肌修复的问题,因此再生和修复疗法对于心肌梗死起着至关重要的作用。而目前,干细胞疗法被认为是治疗心肌梗死具有前景的方法,同时,基于干细胞的旁分泌功能,目前干细胞来源的外泌体在急性心肌损伤中的修复作用成为了研究的热点。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)是利用重编程技术将重编程因子转入成体细胞得到的具有与胚胎干细胞相似的全能性的一类干细胞,基于其来源广泛,同时可以排除免疫排斥及伦理等问题,其在修复损伤组织和器官的治疗中具有广泛的应用前景,但基于其细胞治疗中仍然面临着致瘤性的影响。在外泌体的研究中,基于诱导多能干细胞与胚胎干细胞的相似性,目前有研究已经发现诱导多能干细胞来源的外泌体(induced pluripotent stem cells derived exosome,iPSC-Exo)也可通过抗细胞凋亡、促进细胞存活、促新生血管形成和减少心肌纤维化等来发挥心肌保护作用,而且其分泌的外泌体表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。同时,发现其治疗效果主要是通过旁分泌因子(如:miRNA等)介导。但目前对于iPSC-Exo研究仍处于起步阶段,其发挥作用的具体机制尚未明确。因此为进一步研究iPSC-Exo在心肌损伤修复中的功能,本课题通过提取iPSC-Exo及同一株人包皮成纤维细胞来源的外泌体(human foreskin fibroblast derived from exosome,HFF-Exo),首先探索两组外泌体在心肌损伤修复中的功能差异;然后,通过miRNA组学及生物信息学分析,探索两组间显著差异表达的miRNA,为阐明iPSC-Exo在心肌梗死的治疗中的作用机制提供理论依据。[方法]第一部分:使用蔗糖密度梯度离心法从iPSC及HFF无血清的培养基上清液中提取外泌体;然后,通过透射电镜观察、纳米颗粒追踪技术及Western Blot对提取的外泌体进行鉴定;再通过CCK8、细胞划痕、Transwell、Western Blot及TUNEL凋亡染色来比较两组外泌体对心肌细胞H9C2的增殖、迁移及凋亡能力的影响,以及Matrigel基质胶成管样结构形成实验对内皮细胞HUVEC血管生成的影响;最后进行外泌体摄取实验证实外泌体能被靶细胞所吞噬从而发挥作用。第二部分:随机抽取经鉴定过的iPSC-Exo和HFF-Exo各3组,提取各组外泌体总RNA并进行质检,使用高通量测序技术对样本miRNA组进行测序,对测序后的数据进行分析,寻找iPSC-Exo组和HFF-Exo对照组间的显著差异表达miRNA及其主要调控通路,通过生物信息学分析探索关键的差异miRNA,最后使用miRNA组学再测序验证对关键的差异miRNA进行验证分析。[结果]第一部分:通过蔗糖密度梯度离心法我们成功分离得到iPSC-Exo及HFF-Exo,并通过透射电镜观察、纳米颗粒追踪技术及Western Blot鉴定后均符合外泌体的特性,可用于后续实验;通过CCK8检测显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能够促进H2O2诱导的H9C2心肌细胞损伤模型的存活,但两者对正常H9C2细胞增殖效果不明显;通过Western Blot检测Cleaved caspase-3的表达,结果显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能够减少H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡,TUNEL凋亡染色检测结果也显示跟该结果一致;通过细胞划痕及Transwell实验显示iPSC-Exo比HFF-Exo干预更能促进H9C2细胞迁移能力;通过Matrigel基质胶成管样结构形成实验显示iPSC-Exo 比 HFF-Exo干预更能促进HUVEC血管生成能力;将PKH67荧光标记的iPSC-Exo及HFF-Exo加入到H9C2细胞孵育后显示iPSC-Exo及HFF-Exo均可以被H9C2细胞摄取到细胞内。第二部分:在iPSC-Exo组与HFF-Exo对照组间通过miRNA高通量测序筛选差异miRNA,以P<0.05,Fold Change>1为显著性差异,筛选出70个显著差异的miRNA,iPSC-Exo组与HFF-Exo组相比其中10个miRNA表达上调,60个表达下调;在筛选的70个显著差异的miRNA中,发现了 8个基因簇,包含19个显著差异的miRNA,其中1个基因簇上调、7个基因簇下调;通过对miRNA基因簇所调控的靶基因进行GO分析、pathway分析发现主要参与着细胞存活、细胞凋亡、细胞迁移、血管生成以及肿瘤的发生等过程。进一步对显著差异miRNA进行通路分析,发现它们调控4个参与心肌损伤修复最有可能相关的通路,它们分别为PI3K/Akt信号通路、NF-κB信号通路、AMPK信号通路和JAK/STAT信号通路;最后我们重点挑选调控信号通路中靶基因数最多及结合在心肌损伤修复中可能发挥抗凋亡、促细胞存活、血管生成等作用的miRNA:其中有上调的 miR-92a-3p、miR-103a-3p、miR-106a-5p,下调的 miR-27b-3p、miR-199a-5p、miR-143-3p、miR-221-3p,对其进行 miRNA 表达量验证分析,结果也显示上述miRNA的表达与上述测序的结果一致,因此我们推测iPSC-Exo携带的这些miRNA可能参与着心肌损伤修复过程。[结论]1.iPSC-Exo相比于HFF-Exo在促心肌细胞存活能力、抗心肌细胞凋亡能力、促心肌细胞迁移能力以及促内皮细胞血管生成能力更为显著。2.通过高通量测序,iPSC-Exo与HFF-Exo对照组的miRNA表达谱有明显差异,共筛选出70个显著差异的miRNA,其中10个miRNA表达上调,60个表达下调,这些差异miRNA可能通过调控靶基因参与的PI3K/Akt、NF-κB、AMPK和JAK/STAT四个信号通路参与心肌损伤修复。3.miR-92a-3p、miR-103a-3p、miR-106a-5p、miR-27b-3p、miR-199a-5p、miR-143-3p、miR-221-3p可能与iPSC-Exo发挥心肌损伤修复作用有关。