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绿针假单胞菌是一类具有生物多样性并且对各种生态环境有较强适应能力的植物促生菌,是公认的生态友好的生防菌株。它含有吩嗪合成基因簇及其修饰基因,能生成多种吩嗪衍生物,还能合成多种其他次级代谢产物(如铁载体),以此拮抗植物病原菌,使自身更好的适应生存环境,并能增强对植物根际的定殖能力。吩嗪化合物作为一类广谱的生物农药,其高产具有重要的应用价值。筛选吩嗪化合物的高产菌株和维护高产菌株遗传与生产的稳定性同样具有重要意义。本课题先以高产吩嗪-1-甲酰胺(PCN)的绿针假单胞菌HT66和在其发酵环境高频率出现的不产PCN但自发荧光的异常表型变异菌株HT66-FLUO为研究对象,探究高产菌株变异的原因,有利于确保高产菌株的遗传稳定性与吩嗪化合物的持续高产。我们利用RNA-sequencing技术对HT66和HT66-FLUO生长对数期的基因表达情况进行比较分析。以HT66为对照,鉴定了HT66-FLUO中发生差异表达的基因,根据基因功能进行分类,揭示了哪些基因的表达差异导致HT66-FLUO完全不产PCN并且伴有很强的绿色荧光现象。通过全基因组重测序以及基因工程等手段进一步揭示了该菌株发生表型变异现象的原因。然后以本实验室能够合成吩嗪-1-羧酸(PCA)、2-羟基-吩嗪-1-羧酸(2-OH-PCA)、2-羟基-吩嗪(2-OH-PHZ)的绿针假单胞菌GP72以及衍生菌株为对象,确定了phz基因簇非编码区启动子位置以及影响2-OH-PHZ产量的限速酶等,为后期高产菌株的基因工程改造提供了理论基础。并且初步建立了一种高通量筛选2-OH-PHZ高产菌株的方法,为提高2-OH-PHZ的关键合成酶的转化效率提供新的途径。本课题的主要内容包含以下四个方面:第一、基于RNA-sequencing技术比较分析HT66与其自发表型变异菌株HT66-FLUO在生长对数期基因表达的差异。相较于HT66,HT66-FLUO菌株中共有1418个基因发生差异表达,占总开放阅读框(ORFs)的22%。其中直接参与PCN合成和直接调控吩嗪操纵子转录的群集感应系统phzI/phzR的基因表达大幅度下调,这与HT66-FLUO发酵液中完全检测不到PCN相一致。同时参与合成两种铁载体(pyoverdine和achromobactin)的相关基因显著上调。通过基因敲除和回补,证明了HT66-FLUO的超荧光现象是pyoverdine产量增多导致的。第二、由于异常表型变异菌株HT66-FLUO能够在传代培养中稳定遗传,无回复出发株的现象,利用Whole-genome sequencing技术对HT66-FLUO的基因组重新测序和分析。参考已知序列,我们在HT66-FLUO与HT66的基因组之间没有发现差异。根据表型变异菌株的菌落特征,构建了HT66-FLUO的gacA和gacS过表达菌株。通过形态观察和PCN产量测定,发现过表达gacS能够使HT66-FLUO的细胞表型回复到出发株(如荧光现象消失),同时再次获得PCN合成能力。过表达gacA则没有这种效果。以HT66和HT66-FLUO的基因组为模板,将gacA和gacS基因的编码区和非编码区通过PCR测序,验证Gac系统在DNA水平无差异。我们大胆推测HT66-FLUO的gacS基因可能发生了DNA水平的修饰(如甲基化等)或者翻译后修饰导致GacS蛋白激酶失活,进而影响Gac/Rsm系统对下游基因表达(如PCN合成或铁载体的分泌)的调控作用。通过β-半乳糖苷酶活测定以及RT-PCR检测rsmX、rsmY和rsmZ在HT66和HT66-FLUO两菌株中转录水平的表达差异,发现三种sRNAs在HT66-FLUO中表达均下调,以rsmX下调最为明显。进一步证明了gacA/S基因表达并无明显差别,但由于GacS蛋白失活无法激活下游三种sRNAs的表达,进而影响对次级代谢产物合成的调控。在HT66-FLUO中分别转入rsmX、rsmY和rsmZ的过表达质粒,通过KB固态平板的单菌落形态观察,发现三种sRNAs过表达都能使表型变异菌株向出发株靠拢,但程度不同。检测这三种过表达菌株的PCN产量,结果同样显示,过表达rsmX/Y/Z都能够使HT66-FLUO重新获得合成PCN的能力,其中过表达rsmX的效果更为明显。第三、通过5’RACE对绿针假单胞菌GP72的phz基因簇和phzR基因的转录起始位点进行精确定位,其中phz基因簇的转录起始位点位于phzA基因上游112 bp,phzR的转录起始位点位于其下游29 bp。构建lacZ重组质粒,通过β-半乳糖苷酶活性测定进一步验证了5’RACE结果分析的正确性。对phz基因簇转录起始位点上游不同长度的非编码区进行分段处理,探究是否存在影响其转录水平的抑制区域,结果表明,在这段区域不存在明显影响下游基因表达的抑制区域。同时构建参与合成2-OH-PHZ的各个基因的过表达质粒,初步确认了PhzE和PhzO为影响2-OHPHZ产量的限速酶。第四、通过发酵2-OH-PHZ高产菌株ND3,分离得到2-OH-PHZ纯品。用酶标仪分别对100 mg/L PCA的甲醇溶液和100 mg/L 2-OH-PHZ的甲醇溶液以及相应的KB发酵液进行全波长扫描,分析光吸收图谱,发现2-OH-PHZ在430 nm的吸收波长与PCA有较大吸收差异。故选用430 nm作为2-OH-PHZ高产菌株高通量筛选的检测波长。利用GeneMorph II random mutagenesis kit试剂盒,构建phzO基因易错PCR文库。同时引进TIANprep Rapid N96 Plasmid Kit以及96孔PCR排管,实现大批量的提取和转化重组质粒。舍弃那些不产砖红色2-OH-PHZ而呈乳白色突变菌株(约占整体的30%),达到初筛的目的。随后将初筛后的菌株转移到24深孔板培养,稀释后的发酵液以野生phzO为对照,测其在430 nm的光吸收值。从而构建了一种高通量筛选高产2-OH-PHZ菌株的方法,为2-OH-PHZ的高产策略提供一种新的思路。本文一方面揭示了绿针假单胞菌HT66的基因组无差异却产生异常表型变化的现象,并分析了产生表型差异的原因。通过对高产PCN菌株表型变异菌株的深入研究,为维护吩嗪化合物高产菌株的遗传稳定性打下了一定的基础。另一方面通过对绿针假单胞菌GP72的吩嗪合成基因簇的转录起始位点进行精确定位、确认合成2-OH-PHZ的限速酶,建立2-OH-PHZ的高通量筛选方法,对高产吩嗪菌株的筛选与改造提供了研究策略。