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创伤、肿瘤、炎症及头颈部恶性肿瘤的放射治疗等常造成涎腺不可逆性损伤，导致唾液分泌减少甚至消失，引起口干及咀嚼、发音、言语、消化不良等功能障碍，严重降低患者的生活质量。传统治疗手段并不能从根本上解决问题，而组织工程再生技术及理念则为治疗涎腺功能障碍提供了新的思路。当前，依托于脱细胞支架的心脏、肝脏、肾脏、肺等重要脏器的组织工程再生研究已取得一定的进展，而基于脱细胞支架的涎腺组织工程再生研究相对滞后，报道甚少。因此，本研究采用灌注脱细胞方法制备大鼠颌下腺脱细胞支架，以此探究组织工程涎腺的构建策略。
目的
本实验旨在建立大鼠颌下腺灌注系统，制备颌下腺脱细胞支架，同时建立颌下腺体外培养体系，探究颌下腺细胞和脂肪干细胞在体外构建组织工程涎腺的可行性，探索组织工程涎腺体外构建方法，并探究体外构建组织工程涎腺的体内移植转归，为最终实现可移植的组织工程涎腺提供技术、方法和理论支持。
方法
1．大鼠颌下腺脱细胞支架的制备：
手术显微镜下经SD大鼠颌下腺导管与静脉插管，建立颌下腺灌注系统，通过十二烷基硫酸钠(SDS)、曲拉通X-100(Triton X-100)、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)以及冻融循环的不同组合，制备颌下腺脱细胞支架。HE染色、扫描电镜观察脱细胞支架大体及微观结构；马森染色及Ⅰ、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白的免疫荧光及Westernblot检测，分析颌下腺脱细胞支架细胞外基质存留情况；以胶原定量分析细胞外基质中胶原成分的存留情况；以DNA定量分析及核酸琼脂糖凝胶电泳比较不同方法制备脱细胞支架的DNA残留及片段大小；最后，导管及血管铸型，分析方法2制备颌下腺脱细胞支架导管和静脉系统的存留情况；
2．大鼠颌下腺细胞及脂肪干细胞的分离培养及鉴定：
无菌获取SD大鼠颌下腺与腹股沟脂肪带，分别经Ⅱ型及Ⅰ型胶原酶消化，分离培养颌下腺细胞(submandibular gland cells，SGCs)与脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，倒置显微镜观察活细胞形态，免疫荧光、Westernblot及RT-PCR从蛋白及基因水平检测α-淀粉酶及细胞角蛋白8，鉴定颌下腺细胞；成脂成骨成软骨诱导及流式检测细胞表面CD分子，鉴定脂肪干细胞来源及多向分化能力；
3．脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的实验研究：
利用孔径0.4μm的Transwell小室建立颌下腺细胞与脂肪干细胞间接共培养系统，上室接种颌下腺细胞，下室接种脂肪干细胞，两者比例4∶1。以上室不接种颌下腺细胞的共培养组为对照，共培养7、14、21天后，对共培养的脂肪干细胞进行鉴定，利用免疫荧光、Westernblot及RT-PCR从蛋白及基因水平检测α-淀粉酶的表达，并利用免疫荧光染色结果计数α-淀粉酶阳性细胞，计算脂肪干细胞转分化率；
4．组织工程涎腺的体外构建：
以脂肪干细胞、共培养7天脂肪干细胞及颌下腺细胞为种子细胞，以较佳方法制备的颌下腺脱细胞支架为组织工程支架，经导管灌注再细胞化，于体外构建组织工程涎腺，构建的组织工程涎腺于体外培养3、5、7、10天后，进行形态和种子细胞功能鉴定；以HE染色观察形态结构，α-淀粉酶的表达经免疫荧光、Westernblot及RT-PCR进行比较分析，同时利用Tunel及Ki67免疫荧光染色，观察脂肪干细胞再细胞化组各时间点细胞增殖凋亡情况；
5．富血小板纤维蛋白对体外构建组织工程涎腺的结构及种子细胞功能影响：
抽取兔耳中动脉血，制备富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)，观察新鲜及冻干后PRF外形及微观结构差异，检测冻干PRF体外释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB)的规律；利用冻干PRF制备浸提液，添加到颌下腺细胞和脂肪干细胞共培养系统中，观察其对脂肪干细胞转分化的影响；添加PRF浸提液至7天组织工程涎腺的培养基中，观察其对组织工程涎腺结构和种子细胞功能的影响；
6．组织工程涎腺的体内移植研究：
将以脂肪干细胞和共培养7天脂肪干细胞即刻再细胞化和再细胞化后体外灌注培养3天后的组织工程涎腺进行体内移植，移植部位为完全去除或不去除颌下腺的原位移植。移植所用种子细胞于体外进行慢病毒转染，使其稳定表达绿色荧光蛋白；在体内移植3、5、7天后，取材，进行α-淀粉酶免疫荧光染色，同时显微镜下精细解剖只取部分移植组织，进行α-淀粉酶Westernblot及其基因RT-PCR检测分析，对细胞功能进行评价；
结果
1．成功制备大鼠颌下腺脱细胞支架：
手术显微镜下经大鼠颌下腺静脉及导管成功插管，在体外利用插管连接蠕动泵，通过静脉系统建立大鼠颌下腺的逆行灌注系统。利用SDS、TritonX-100、胰蛋白酶、DNaseⅠ以及冻融循环不同组合的三种方法，均制备出透明状的脱细胞支架。但经HE染色、扫描电镜观察组织结构，马森染色及Ⅰ、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白的免疫荧光及Westernblot检测细胞外基质存留情况来看，以-80℃冷冻24h+1%SDS4h+TritonX-1002h+DNaseI2h的脱细胞方法(方法2)，制备的脱细胞支架能较彻底的去除细胞成分，同时又能较完整的保留组织三维结构和细胞外基质成分。
2．成功分离培养大鼠颌下腺细胞和脂肪干细胞：
分别经Ⅱ型和Ⅰ型胶原酶消化，成功分离培养颌下腺细胞和脂肪干细胞。颌下腺细胞呈圆形、卵圆形或多边形，铺路石样排列，表达α-淀粉酶及CK8，不表达波形蛋白。脂肪干细胞呈长梭形，阳性表达CD29、CD90及CD105，具有成脂、成骨及成软骨多向分化潜能。
3．脂肪干细胞具备向涎腺腺泡样细胞转分化的潜能：
经与颌下腺细胞共培养，部分脂肪干细胞阳性表达α-淀粉酶，经免疫荧光染色计算干细胞转分化率，7天、14天、21天细胞转分化率分别为：(20.45±1.41)%，(39.06±2.19)%，(47.58±1.87)%，转分化率呈上升趋势。同时Westernblot及RT-PCR从蛋白和基因水平证实了α-淀粉酶的表达，表达量随时间增加而上升。
4．在体外成功构建具有腺泡样结构的组织工程涎腺：
分别经导管一次性灌注脂肪干细胞、共培养7天脂肪干细胞及颌下腺细胞，实现了颌下腺脱细胞支架的再细胞化。于体外导管灌注培养3、5、7、10天后，构建的组织工程涎腺形成腺泡样结构，但随时间的增加，7天和10天组腺泡样结构的数量明显减少。各组不同程度的表达α-淀粉酶：同一时间点，以颌下腺细胞构建组织工程涎腺α-淀粉酶表达水平最高，其次为共培养脂肪干细胞构建组织工程涎腺，最后为脂肪干细胞构建组织工程涎腺。同一组不同时间点，则为5天时各组α-淀粉酶表达水平最高。
5．富血小板纤维蛋白能够在一定程度上改善组织工程涎腺结构和种子细胞功能：
抽取兔耳中动脉血，成功制备富血小板纤维蛋白(PRF)，新鲜PRF呈凝胶状，冻干后可研磨成颗粒，其在体外一定时间内能够持续释放VEGF和PDGF-BB。α-淀粉酶免疫荧光、Westernblot及RT-PCR显示，PRF能够促进脂肪干细胞转分化，与正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且这种作用具有计量依赖性；此外，PRF能够在一定程度上改善7天培养组织工程涎腺的结构，增加存留腺泡样结构的数量，同时能够提高α-淀粉酶的表达水平。
6．组织工程涎腺体内移植后能在短时间内表达α-淀粉酶：
组织工程涎腺体内移植3,5,7天后，HE染色显示，组织结构较体外培养差，腺泡样结构少见；仍有细胞稳定表达绿色荧光蛋白，并且这些细胞α-淀粉酶免疫荧光染色呈阳性，表明移植细胞部分存活，且具有一定功能；同时，α-淀粉酶Westernblot及RT-PCR同样证实，移植组织工程涎腺内细胞短时间内能保持一定的功能。
结论
1．通过建立颌下腺灌注系统，首次利用灌注法成功制备符合公认标准的大鼠颌下腺脱细胞支架；
2．由涎腺细胞提供微环境，脂肪干细胞可以转分化为涎腺腺泡样细胞，从而作为构建组织工程涎腺的种子细胞之一；
3．在体外，利用脂肪干细胞、共培养诱导脂肪干细胞及颌下腺细胞，经导管灌注再细胞化，可以成功构建组织工程涎腺，它能在一定时间内维持腺泡样结构，并表达α-淀粉酶；
4．富血小板纤维蛋白能够促进脂肪干细胞转分化，并能改善7天体外培养组织工程涎腺的结构，同时提高种子细胞α-淀粉酶的表达；
5．体外构建的组织工程涎腺进行体内移植，可以在短时间内维持种子细胞功能；
目的
本实验旨在建立大鼠颌下腺灌注系统，制备颌下腺脱细胞支架，同时建立颌下腺体外培养体系，探究颌下腺细胞和脂肪干细胞在体外构建组织工程涎腺的可行性，探索组织工程涎腺体外构建方法，并探究体外构建组织工程涎腺的体内移植转归，为最终实现可移植的组织工程涎腺提供技术、方法和理论支持。
方法
1．大鼠颌下腺脱细胞支架的制备：
手术显微镜下经SD大鼠颌下腺导管与静脉插管，建立颌下腺灌注系统，通过十二烷基硫酸钠(SDS)、曲拉通X-100(Triton X-100)、胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ(DNaseⅠ)以及冻融循环的不同组合，制备颌下腺脱细胞支架。HE染色、扫描电镜观察脱细胞支架大体及微观结构；马森染色及Ⅰ、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白的免疫荧光及Westernblot检测，分析颌下腺脱细胞支架细胞外基质存留情况；以胶原定量分析细胞外基质中胶原成分的存留情况；以DNA定量分析及核酸琼脂糖凝胶电泳比较不同方法制备脱细胞支架的DNA残留及片段大小；最后，导管及血管铸型，分析方法2制备颌下腺脱细胞支架导管和静脉系统的存留情况；
2．大鼠颌下腺细胞及脂肪干细胞的分离培养及鉴定：
无菌获取SD大鼠颌下腺与腹股沟脂肪带，分别经Ⅱ型及Ⅰ型胶原酶消化，分离培养颌下腺细胞(submandibular gland cells，SGCs)与脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)，倒置显微镜观察活细胞形态，免疫荧光、Westernblot及RT-PCR从蛋白及基因水平检测α-淀粉酶及细胞角蛋白8，鉴定颌下腺细胞；成脂成骨成软骨诱导及流式检测细胞表面CD分子，鉴定脂肪干细胞来源及多向分化能力；
3．脂肪干细胞转分化为涎腺腺泡样细胞的实验研究：
利用孔径0.4μm的Transwell小室建立颌下腺细胞与脂肪干细胞间接共培养系统，上室接种颌下腺细胞，下室接种脂肪干细胞，两者比例4∶1。以上室不接种颌下腺细胞的共培养组为对照，共培养7、14、21天后，对共培养的脂肪干细胞进行鉴定，利用免疫荧光、Westernblot及RT-PCR从蛋白及基因水平检测α-淀粉酶的表达，并利用免疫荧光染色结果计数α-淀粉酶阳性细胞，计算脂肪干细胞转分化率；
4．组织工程涎腺的体外构建：
以脂肪干细胞、共培养7天脂肪干细胞及颌下腺细胞为种子细胞，以较佳方法制备的颌下腺脱细胞支架为组织工程支架，经导管灌注再细胞化，于体外构建组织工程涎腺，构建的组织工程涎腺于体外培养3、5、7、10天后，进行形态和种子细胞功能鉴定；以HE染色观察形态结构，α-淀粉酶的表达经免疫荧光、Westernblot及RT-PCR进行比较分析，同时利用Tunel及Ki67免疫荧光染色，观察脂肪干细胞再细胞化组各时间点细胞增殖凋亡情况；
5．富血小板纤维蛋白对体外构建组织工程涎腺的结构及种子细胞功能影响：
抽取兔耳中动脉血，制备富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin，PRF)，观察新鲜及冻干后PRF外形及微观结构差异，检测冻干PRF体外释放血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB)的规律；利用冻干PRF制备浸提液，添加到颌下腺细胞和脂肪干细胞共培养系统中，观察其对脂肪干细胞转分化的影响；添加PRF浸提液至7天组织工程涎腺的培养基中，观察其对组织工程涎腺结构和种子细胞功能的影响；
6．组织工程涎腺的体内移植研究：
将以脂肪干细胞和共培养7天脂肪干细胞即刻再细胞化和再细胞化后体外灌注培养3天后的组织工程涎腺进行体内移植，移植部位为完全去除或不去除颌下腺的原位移植。移植所用种子细胞于体外进行慢病毒转染，使其稳定表达绿色荧光蛋白；在体内移植3、5、7天后，取材，进行α-淀粉酶免疫荧光染色，同时显微镜下精细解剖只取部分移植组织，进行α-淀粉酶Westernblot及其基因RT-PCR检测分析，对细胞功能进行评价；
结果
1．成功制备大鼠颌下腺脱细胞支架：
手术显微镜下经大鼠颌下腺静脉及导管成功插管，在体外利用插管连接蠕动泵，通过静脉系统建立大鼠颌下腺的逆行灌注系统。利用SDS、TritonX-100、胰蛋白酶、DNaseⅠ以及冻融循环不同组合的三种方法，均制备出透明状的脱细胞支架。但经HE染色、扫描电镜观察组织结构，马森染色及Ⅰ、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维连接蛋白的免疫荧光及Westernblot检测细胞外基质存留情况来看，以-80℃冷冻24h+1%SDS4h+TritonX-1002h+DNaseI2h的脱细胞方法(方法2)，制备的脱细胞支架能较彻底的去除细胞成分，同时又能较完整的保留组织三维结构和细胞外基质成分。
2．成功分离培养大鼠颌下腺细胞和脂肪干细胞：
分别经Ⅱ型和Ⅰ型胶原酶消化，成功分离培养颌下腺细胞和脂肪干细胞。颌下腺细胞呈圆形、卵圆形或多边形，铺路石样排列，表达α-淀粉酶及CK8，不表达波形蛋白。脂肪干细胞呈长梭形，阳性表达CD29、CD90及CD105，具有成脂、成骨及成软骨多向分化潜能。
3．脂肪干细胞具备向涎腺腺泡样细胞转分化的潜能：
经与颌下腺细胞共培养，部分脂肪干细胞阳性表达α-淀粉酶，经免疫荧光染色计算干细胞转分化率，7天、14天、21天细胞转分化率分别为：(20.45±1.41)%，(39.06±2.19)%，(47.58±1.87)%，转分化率呈上升趋势。同时Westernblot及RT-PCR从蛋白和基因水平证实了α-淀粉酶的表达，表达量随时间增加而上升。
4．在体外成功构建具有腺泡样结构的组织工程涎腺：
分别经导管一次性灌注脂肪干细胞、共培养7天脂肪干细胞及颌下腺细胞，实现了颌下腺脱细胞支架的再细胞化。于体外导管灌注培养3、5、7、10天后，构建的组织工程涎腺形成腺泡样结构，但随时间的增加，7天和10天组腺泡样结构的数量明显减少。各组不同程度的表达α-淀粉酶：同一时间点，以颌下腺细胞构建组织工程涎腺α-淀粉酶表达水平最高，其次为共培养脂肪干细胞构建组织工程涎腺，最后为脂肪干细胞构建组织工程涎腺。同一组不同时间点，则为5天时各组α-淀粉酶表达水平最高。
5．富血小板纤维蛋白能够在一定程度上改善组织工程涎腺结构和种子细胞功能：
抽取兔耳中动脉血，成功制备富血小板纤维蛋白(PRF)，新鲜PRF呈凝胶状，冻干后可研磨成颗粒，其在体外一定时间内能够持续释放VEGF和PDGF-BB。α-淀粉酶免疫荧光、Westernblot及RT-PCR显示，PRF能够促进脂肪干细胞转分化，与正常组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且这种作用具有计量依赖性；此外，PRF能够在一定程度上改善7天培养组织工程涎腺的结构，增加存留腺泡样结构的数量，同时能够提高α-淀粉酶的表达水平。
6．组织工程涎腺体内移植后能在短时间内表达α-淀粉酶：
组织工程涎腺体内移植3,5,7天后，HE染色显示，组织结构较体外培养差，腺泡样结构少见；仍有细胞稳定表达绿色荧光蛋白，并且这些细胞α-淀粉酶免疫荧光染色呈阳性，表明移植细胞部分存活，且具有一定功能；同时，α-淀粉酶Westernblot及RT-PCR同样证实，移植组织工程涎腺内细胞短时间内能保持一定的功能。
结论
1．通过建立颌下腺灌注系统，首次利用灌注法成功制备符合公认标准的大鼠颌下腺脱细胞支架；
2．由涎腺细胞提供微环境，脂肪干细胞可以转分化为涎腺腺泡样细胞，从而作为构建组织工程涎腺的种子细胞之一；
3．在体外，利用脂肪干细胞、共培养诱导脂肪干细胞及颌下腺细胞，经导管灌注再细胞化，可以成功构建组织工程涎腺，它能在一定时间内维持腺泡样结构，并表达α-淀粉酶；
4．富血小板纤维蛋白能够促进脂肪干细胞转分化，并能改善7天体外培养组织工程涎腺的结构，同时提高种子细胞α-淀粉酶的表达；
5．体外构建的组织工程涎腺进行体内移植，可以在短时间内维持种子细胞功能；