猪ITGB1BP2和ADPLA基因的转录调控分析

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猪,作为的主要家畜之一,由于它与人在生理、生化以及遗传等方面的相似性,导致了它已经成为研究肥胖和糖尿病以及其他一些人类疾病最理想的动物模型,而且猪肉一直是人类餐桌上最常见、最重要的动物性食品之一。因此,了解猪肌肉和脂肪组织的生长发育有着重要意义。为此,我们在分子水平上做了以下一些研究:  (1)采用实时定量PCR检测猪ITGB1BP2和ADPLA基因的表达情况,发现猪TGB1BP2基因主要是在心脏中表达,而在其它组织中表达量很低且在猪背最长肌形成过程中,ITGB1BP2从胚胎时期就开始表达了,出生时表达量达到最高,之后呈下降趋势,此外该基因在大白猪背最长肌中的表达量要高于梅山猪(除生后180天外);猪ADPLA基因在不同组织中泛表达,但在脂肪组织的表达要显著高于其它组织。  (2)使用NCBI和EBI寻找ITGB1BP2和ADPLA基因5′端上游调控序列,以此为模板,我们克隆了猪ITGB1BP2基因5′端上游调控序列1442bp,且发现在大白猪和梅山猪上存在13个潜在的SNP位点,并鉴定了-1227bp处的大白猪T/梅山猪G突变;而1513bp的猪ADPLA基因5′端上游调控序列包含完整的第一内含子,且在大白猪和梅山猪上有7个潜在SNP位点和2处碱基缺失,鉴定了-321bp处存在大白猪C/梅山猪A突变。  (3)通过5′RACE鉴定了这两个基因的转录起始位点,发现猪ITGB1BP2基因的转录起始位点为-91bp处的胞嘧啶;而猪ADPLA基因上发现了2个转录起始位点,即-635bp处的鸟嘌呤和-350bp处的鸟嘌呤。  (4)利用生物信息学和比较基因组学的方法分析这两个基因的5′端上游调控序列,发现猪ITGB1BP2基因的5′端上游调控区域内含有TATA-box和GC-box,以及很多常见的转录因子结合位点,其中潜在的肌肉特异性转录因子MEF2和MyoD的结合位点在不同物种中保守性很高,但是没有发现CpG岛;在猪ADPLA基因的5′端上游调控区域内同样发现了TATA-box,以及很多常见的转录因子结合位点,其中CREB和SREBP-1结合位点在不同物种中也是保守的,并发现了一个CpG岛。  (5)构建了含系列缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,并检测它们在不同的细胞系中的活性差异,结果发现,这两个基因在大白猪中的启动子活性都要显著高于梅山猪,猪ITGB1BP2基因的核心启动子位于-304~-23bp,而猪ADPLA基因在-656~-616和-521~-347这两个区域内均具有独立的启动基因表达的能力。  (6)为了ITGB1BP2和ADPLA的5′端上游调控区域内潜在的重要转录因子结合位点,采用超表达的方法检测转录因子MEF-2C和MyoD对启动子活性的影响,结果表明肌肉特异性转录因子MEF-2C和MyoD超表达载体均能显著性提高猪ITGB1BP2启动子活性,而forskolin和CREB-1超表达载体也都能提高猪ADPLA启动子活性。
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