【研究目的】缺氧是恶性实体肿瘤中晚期进展最重要的微环境特征,缺氧诱导因子2α（HIF-2α）基因参与调控了肿瘤缺氧微环境中肿瘤进展的多种分子机制。肝细胞肝癌是肿瘤疾病谱中最常见的恶性肿瘤之一,HIF-2α及其下游调控基因DLST、PPP1R8参与调控了肝癌增殖、侵袭、转移及细胞凋亡的多种机制。本研究拟在探讨HIF-2α及其下游基因DLST、PPP1R8在肝癌临床标本及细胞系中的表达情况,明确他们的调控关系,并进一步探讨DLST、PPP1R8基因在肝癌中的作用机制,为肝癌的防治提供新的科学思路。【研究内容和方法】首先,我们在课题组前期实验论证基础上,运用基因芯片技术对HIF-2α干扰后的Hep3B细胞系进行全基因组差异表达谱检测,并进行基因集及信号通路富集。筛选出相关性较好的差异表达基因在不同细胞系进行实时荧光PCR验证,筛选与HIF-2α调控肿瘤进展最可能相关的下游靶基因DLST、PPP1R8,并进行生物信息学检索比对。其次,我们运用免疫组化和免疫印迹实验检测临床肝细胞肝癌组织标本中的HIF-2α、DLST、PPP1R8蛋白表达情况,并结合临床病理资料探讨DLST、PPP1R8基因对肝癌临床预后的影响。最后,在细胞系模拟缺氧培养条件下,我们利用慢病毒转染RNAi技术构建Lvsh-HIF-2αHep3B、Hep G2细胞系,并在该细胞系利用脂质体瞬时转染技术过表达DLST、PPP1R8基因,运用CCK8、Transwell、流式细胞检测Annexin V-FITC技术进行细胞增殖、侵袭迁移和凋亡等细胞功能学验证。我们利用TCGA数据库及GSEA生物信息学分析方法对DLST、PPP1R8在肝癌组织中基因共表达和基因功能及信号通路进行富集,并探讨最有可能的分子生物学机制。【研究结果】1.基因芯片分析提示HIF-2α下游差异表达基因共1352个,其中上调674个,下调678个,差异基因主要富集于代谢与肿瘤相关通路中,与细胞大分子代谢功能、MAPK及Pathways in cancer信号通路密切相关,HIF-2α及其下游基因DLST、PPP1R8在Hep3B、Hep G2细胞系的q RT-PCR验证结果及TCGA、Oncomine数据库生物信息学挖掘分析结果提示:DLST、PPP1R8高表达可作为HIF-2α调控下的一种促癌基因可能在肝癌的发生发展中起着重要的作用。2.临床实验研究中,在同一肝癌新鲜冰冻组织及连续病理切片组织中,相比于癌旁组织,HIF-2α和DLST、PPP1R8蛋白呈高表达状态。进一步分析与临床病理因素的相关性提示,DLST表达水平与血管侵犯、肿瘤埃德蒙森分级、肿瘤包膜、肿瘤TNM分期显著相关。而PPP1R8蛋白表达与肿瘤直径、肿瘤结节、血管侵犯、肿瘤埃德蒙森分级、肿瘤包膜、血清甲胎蛋白（AFP）、肿瘤TNM分期显著相关。生存分析统计提示:DLST、PPP1R8蛋白高表达患者总生存期明显低于低表达者。3.细胞生物学实验提示,HIF-2αsh RNA干扰后,肝癌细胞稳转细胞系的增殖、侵袭迁移能力均明显减弱,而凋亡率明显增加,同一稳转细胞系过表达DLST、PPP1R8后,细胞系生物学行为发生逆转。生物信息学技术,利用GO及KEGG分析富集DLST、PPP1R8共表达基因及信号通路,提示DLST及其共表达基因主要富集于三羧酸循环代谢通路,PPP1R8及其共表达基因富集于DNA损伤修复代谢通路。【研究结论】临床研究提示HIF-2α与DLST、PPP1R8共同参与肝细胞肝癌的增殖、转移等生物学过程,基因芯片提示HIF-2α可能通过调控下游多种基因影响肝细胞肝癌的发展预后。细胞学功能学实验提示HIF-2α通过调控下游靶基因DLST、PPP1R8促进肝癌的增殖和转移,并在肝癌细胞三羧酸循环及DNA损伤修复代谢通路中发挥重要作用。