妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期首次出现或发生的糖代谢异常。以往报道发病率2~5%,GDM可以造成子痫前期、巨大儿、肩难产、新生儿高胆红素血症、RIDS等母儿并发症,严重影响母婴健康。目前认为GDM的发病机制包括:脂肪细胞功能的改变、胎盘和激素的变化、炎症和氧化应激。这些均与胰岛素抵抗有关。而脂肪细胞因子与胰岛素抵抗关系密切。丝氨酸蛋白酶抑制剂(vaspin)是一种新的具有胰岛素增敏作用的脂肪细胞因子,属于丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族。近来报道其与T2DM的发生有关。但关于vaspin与GDM的关系,研究尚少。本研究分别测定妊娠中、晚期GDM患者血清及脐血vaspin水平,探讨其与糖、脂代谢及胰岛素抵抗间关系,同时测定胎盘组织vaspin m RNA及蛋白含量,比较GDM与正常妊娠胎盘组织vaspin转录及蛋白水平的差异以及与新生儿体质量间的关系,以探讨vaspin在GDM发生中的作用和与胎儿生长发育的关系。本研究还通过Be Wo细胞的体外培养,观察IL-6、高糖等不同因子对Be Wo细胞vaspin表达的影响,探讨其调控机制。第一部分GDM患者妊娠中期血清Vaspin水平目的:测定vaspin在妊娠中期血清中的表达,探讨vaspin在妊娠期糖尿病(GDM)发病中的作用及其与胰岛素抵抗的相关性。方法:选择2013年1月至2013年6月于河北省人民医院妇产科就诊的孕24~28周的单胎孕妇,根据75g葡萄糖耐量试验(OGTT)结果,分为GDM组30例和正常妊娠组(NGT)28例;同期在体检中心健康查体的糖耐量正常的健康育龄非妊娠妇女(NC)27例为正常对照组。采用葡萄糖氧化酶法检测各组妇女空腹血糖(FPG)、服糖后1h及2h血糖水平;采用放射免疫法检测各组妇女空腹胰岛素(FIN)水平并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);检测各组妇女的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平;ELISA法测定血清vaspin、IL-6水平。结果1 GDM组妇女TC、TG、HDL及LDL水平分别为(5.52±0.87)、(2.79±0.77)、(1.75±0.44)及(3.34±0.77)mmol/L,NGT组妇女分别为(5.85±0.78)、(2.52±0.71)、(1.94±0.39)及(3.4±0.62)mmol/L,两组妇女血脂水平明显高于正常对照组,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2 GDM组空腹血糖、糖耐量1h血糖及糖耐量2h血糖[(5.48±0.69、10.87±1.84、8.55±1.76)mmol/L]均明显高于NGT组[(4.54±0.28、7.42±1.33、6.2±0.92)mmol/L]和NC组[(5.16±0.42、7.58±0.83、6.75±0.68)mmol/L],分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3 GDM组妇女INS水平(14.03±5.57μU/m L)、HOMA-IR(3.45±1.46)明显高于NGT组(11.49±4.18μU/m L;2.32±0.86)及NC组(8.88±3.75μU/m L;2.03±0.87),分别比较差异有统计学意义(P<0.05)。4 GDM组及NGT组妇女血清vaspin水平[分别为(5.10±2.36)、(5.43±1.88)ng/m L]显著高于NC组(2.03±2.34ng/m L),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);GDM组妇女血清vaspin水平虽略低于NGT组,但差异无统计学意义(P>0.05)。5 GDM组及NGT组妇女血清IL-6水平[分别为(296.96±122.38)、(286.80±97.66)ng/m L]均显著高于NC组(234.38±90.86ng/m L),分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);GDM组妇女血清IL-6水平虽略高于NGT组,但差异无统计学意义(P>0.05)。6 GDM组和NGT组妇女vaspin水平与FPG、HOMA-IR等指标均无相关性(r分别=-0.16,-0.01,0.33,P>0.05)。而血清vaspin水平与胆固醇(r:0.42,P:0.02;r:0.71,P<0.01)及甘油三酯(r:0.51,P<0.01;r:0.38,P:0.046)均呈正相关,GDM组vaspin水平与IL-6呈负相关(r:-0.47,P:0.01)。NC组血清vaspin水平与INS及HOMA-IR呈负相关(r:-0.42P:0.03;r:-0.41,P:0.03)。7 NGT组血清IL-6水平与空腹血糖相关(r:0.52,P:0.01)。GDM组IL-6与空腹血糖(r:0.54,P<0.01)、孕前(r:0.44,P:0.02)及当前BMI(r:0.45,P:0.01)相关。结论1妊娠期vaspin水平较健康非妊娠妇女明显升高,而这种升高与孕妇的血糖状态无关,vaspin主要来自胎盘分泌。2 Vaspin可能参与糖、脂代谢,与GDM的发生相关。3 Vaspin可能是GDM时脂代谢指标,并受IL-6影响。第二部分GDM患者妊娠晚期血清及脐血vaspin水平目的:测定vaspin、IL-6在GDM及正常妊娠妇女妊娠晚期血清及脐血中的表达水平,探讨两者在GDM发生中的作用。方法:选取河北省人民医院妇产科于2012年10月至2013年10月行择期剖宫产终止妊娠的单胎孕妇。根据妊娠中期75g葡萄糖耐量试验(OGTT)结果,分为GDM组30例和正常妊娠组(NGT)27例。采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG),采用放射免疫法检测各组妇女空腹胰岛素(FIN)水平并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);检测各组妇女的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)水平;酶联免疫吸附法(ELISA)法测定血清vaspin、IL-6水平。结果1 GDM组TC、TG、HDL及LDL水平分别为(4.67±0.89)、(3.26±1.03)、(1.32±0.23)及(2.73±0.75)mmol/L,NGT组妇女分别为(4.93±0.79)、(2.80±0.93)、(1.40±0.26)及(2.89±0.69)mmol/L,两组比较无明显区别(P>0.05)。2 GDM组空腹血糖和糖化血红蛋白分别为(4.61±0.58)mmol/L、(5.88±0.38),NGT组空腹血糖为(4.23±0.51)mmol/L,糖化血红蛋白水平为(5.48±0.38),两组相比GDM组明显高于NGT组(P<0.05,P<0.01)。3 GDM组和NGT组胰岛素水平及胰岛素抵抗指数无明显区别(12.68±4.74 vs 11.63±4.91,P=0.41;2.38±1.48 vs 2.24±1.08,P=0.17)。4 GDM组和NGT组产前及产后三天血清vaspin水平分别为[(0.49±0.24)、(0.83±0.27)]ng/m L,和[(0.36±0.13),(0.74±0.31)]ng/ml,两组相比妊娠晚期GDM组血清vaspin水平明显低于NGT组(P<0.01);产后三天vaspin水平均下降,但以GDM组vaspin水平下降明显(P<0.01);GDM组和NGT组脐血vaspin水平分别为(0.34±0.12)(0.44±0.25)]ng/m L;两组相比无明显区别(P>0.05)。5 GDM组和NGT组产前及产后三天血清IL-6水平分别为[(358.70±169.39)、(271.21±148.91)]pg/ml和[(271.21±148.91)、(255.16±142.09)]pg/ml。两组相比GDM组血清IL-6水平明显升高(P=0.04);两组产前与产后血清IL-6水平均无明显变化。而GDM组和NGT组脐血IL-6水平分别为[(383.92±213.25)、(336.95±140.70)]pg/ml,两组相比差异无显著性(P>0.05)。6相关性分析表明:NGT组,血清vaspin水平与TG、LDL呈正相关(r:0.45,P:0.02;r:0.42,P:0.03),血清IL-6水平与VLDL呈负相关(r:-0.42,P:0.03),与FPG正相关。而在GDM组,血清IL-6水平与孕前及孕晚期体重指数呈正相关(r:0.50,P:0.01;r:0.40,P:0.03)。与血清vaspin水平水平呈负相关。结论1妊娠晚期GDM患者血清vaspin水平下降,分娩三天后进一步降低。提示vaspin是GDM的保护因子,并主要由胎盘分泌。2 NGT组,血清vaspin水平与甘油三酯、极低密度脂蛋白呈正相关,提示vaspin可能参与了脂代谢的调控。3 妊娠晚期GDM患者血清IL-6水平升高,支持氧化应激和炎症反应参与GDM的发生这一理论。4 GDM患者血清vaspin水平与IL-6水平负相关,提示两者间具某种联系,IL-6可能对vaspin有抑制作用第三部分GDM患者胎盘组织中vaspin的表达目的:测定vaspin、IL-6 m RNA和蛋白在孕晚期GDM及正常妊娠妇女胎盘组织中的表达水平,探讨两者在GDM发病中的作用。方法:于剖宫产术中收集胎盘组织,GDM组、正常妊娠组(NGT)各20例。用荧光定量PCR(real-time FQ RT-PCR)检测胎盘组织vaspin及IL-6m RNA的表达水平,免疫印迹法(Western blotting)检测胎盘组织vaspin及IL-6蛋白的表达水平。结果1 GDM组和NGT组vaspin m RNA及蛋白表达无明显区别(0.60±0.32vs 0.68±0.32,P=0.46;0.30±0.08 vs 0.39±0.26,P=0.33)。2 GDM组胎盘组织IL-6 m RNA及蛋白表达明显高于NGT组(1.35±0.67 vs 0.82±0.47,P=0.01;1.23±0.25 vs 0.54±0.20,P<0.01)。3相关性分析表明:胎盘组织vaspin的表达与血清vaspin无明显相关性(P>0.05);GDM组,vaspin m RNA与糖化血红蛋白呈负相关(r:-0.71,P:0.01),而与新生儿体质量呈负相关((r=-0.48,P=0.03;r=-0.88,P<0.01),与胎盘组织IL-6 m RNA表达呈负相关关系。结论1 GDM孕妇胎盘组织vaspin m RNA和蛋白表达与IL-6呈负相关关系。提示IL-6可能参与了vaspin的调节。2胎盘组织分泌的vaspin可能通过自分泌/旁分泌在胎盘局部发挥作用,并可能参与了GDM时胎儿的生长发育调节。第四部分IL-6对滋养细胞vaspin表达的影响目的:Vaspin作为一种具有胰岛素增敏作用的脂肪细胞因子,主要由内脏脂肪组织分泌。妊娠时在胎盘表达,其调节机制不明。本研究旨在探讨不同因子作用下Be Wo细胞vaspin表达的变化,分析其调控机制。方法:分别以不同浓度的IL-6(1,5,10ng/ml)、葡萄糖(5.5,10,30mmol/L)和吡格列酮(10,100ummol/L)分别作用人绒癌滋养细胞株Be Wo细胞12、24、48和72h。留取细胞采用RT-PCR及westernblot检测Be Wo细胞中vaspin转录水平和蛋白水平的变化。结果1不同浓度的IL-6(1,5,10ng/ml)作用Be Wo细胞培养12、24、48、72h后,与空白对照相比,均可抑制Be Wo细胞vaspin m RNA和蛋白表达。以IL-6浓度10ng/ml,作用48h时最明显。而对Be Wo细胞中的PPAR-γm RNA和蛋白表达无明显影响。2以不同浓度的葡萄糖(5.5,10,30mmol/L),分别作用Be Wo细胞48小时后。均可抑制vaspin和PPAR-γ的m RNA和蛋白表达,且随葡萄糖浓度增加,抑制效果越强。3以不同浓度的吡格列酮(10,100umol/L),分别作用于Be Wo细胞12h、24h、48和72小时,结果:10umol/L的吡格列酮作用Be Wo细胞12h、24h均可明显上调vaspin m RNA的表达(P<0.05),而100umol/L的吡格列酮在48h反而略有抑制作用(P<0.05)。10umol/L和100umol/L的吡格列酮作用Be Wo细胞12h、24h均可抑制PPAR-γm RNA的表达(P<0.05),在48h后该抑制作用消失(P<0.01,P<0.05)。结论:IL-6、葡萄糖和吡格列酮均参与滋养细胞vaspin表达的调控,并呈浓度依赖性表现。IL-6、葡萄糖抑制vaspin表达,而吡格列酮则上调vaspin的表达。IL-6对滋养细胞PPAR-γ表达无影响,IL-6可以下调vaspin表达,提示vaspin受炎症因子作用参与GDM的发生和发展。IL-6对vaspin的影响不是通过PPAR-γ途径。滋养细胞vaspin分泌受多种因素调节,可能与氧化应激和炎症反应有关,但其调控的确切机制还需进一步研究。