目的:流行病学调查发现,2型糖尿病患者发生阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的风险较对照人群高2-3倍,但其原因却知之甚少。目前已知,引起大脑认知功能障碍的主要因素有:氧化应激损伤、β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ)增多、脂肪酸增多等因素。2型糖尿病状态下,以及糖尿病发病前期的单纯胰岛素抵抗状态下,大脑中是否已存在上述认知功能障碍相关因素?值得探讨。氧化应激被公认为是导致认知功能障碍的一大关键因素。大脑富含不饱和脂肪酸,因而对氧化应激格外敏感。在单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,脑中氧化应激的标志性指标:脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量是否增加?总抗氧化能力(T-AOC)和主要的抗氧酶:超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)活性如何改变?脑中Aβ增多,是引起AD认知障碍的另一关键致病因素。Aβ由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)裂解产生。APP有两种裂解途径,一种是APP依次经β-和γ-分泌酶作用产生Aβ的途径;另一种是α-分泌酶在Aβ序列内裂解APP,阻止Aβ的途径。单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,脑组织Aβ生成是否增多?APP、β-分泌酶(BACE1)和α-分泌酶(ADAM10)基因的转录水平是否改变?脑中脂肪酸增多是很多认知功能障碍相关疾病的发病原因之一。细胞内的脂肪酸主要通过线粒体和过氧化物酶体中的β-氧化途径分解。短链、中链和大部分长链脂肪酸主要在线粒体分解。其中,长链脂肪酸活化形成长链脂酰辅酶A后,需经过肉碱脂酰转移酶(carnitine acetyl transferase, CPT)Ⅰ、Ⅱ的催化,将其转运至线粒体内进行β-氧化。其中,CPT-Ⅰ是线粒体长链脂肪酸β-氧化的限速酶。极长链脂肪酸则主要在过氧化物酶体分解。过氧化物酶体中存在两条β-氧化途径,一条途径主要与直链脂肪酸的氧化有关,由脂酰辅酶A氧化酶1(acyl CoA oxidase 1, ACOX1)、L-双功能蛋白(L-bifunctional protein, LBP)、硫解酶(thiolase A,THLA和thiolase B, THLB)组成;另一条途径主要与支链脂肪酸的氧化有关,由脂酰CoA氧化酶3(acyl CoA oxidase 3, ACOX3)、D-双功能蛋白(D-bifunctional protein, DBP)、固醇携带蛋白x(sterol carrier protein x, SCPx)组成。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα, PPARα)在调节脂肪酸代谢过程中发挥重要作用,可通过上调其下游基因(CPTⅠ、ACOX等)在转录水平的表达,来加速脂肪酸的分解。单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,脑内上述脂肪酸β-氧化相关基因表达如何变化?是否存在脂肪酸的增多?基于上述目的,本实验用高脂饮食诱导大鼠产生胰岛素抵抗,再复加小剂量STZ,造成2型糖尿病。继而观察单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病状态下,脑组织中氧化应激水平、Aβ含量、脂肪酸含量等引起认知功能损伤的因素变化,为探讨2型糖尿病患者发生阿尔茨海默病认知功能障碍的可能分子机理提供实验依据。方法:1动物分组及取材根据本试验室王晓凌等的造模方法,以成年雄性SD大鼠(体重220-240g)为实验对象,用高脂饮食(脂类以猪油为主,热量比占59.8%)复制胰岛素抵抗模型;在胰岛素抵抗的基础上,一次性注射小剂量STZ复制2型糖尿病大鼠模型。大鼠血清,用于血糖、血胆固醇测定;大脑组织,用于Aβ、MDA、脂肪酸含量、抗氧酶活性的测定,以及总RNA的提取。2血糖、血胆固醇的测定采用葡萄糖氧化酶法,胆固醇氧化酶法,用HITACHI 7170A型全自动生化分析仪测定血糖、血胆固醇。3脑组织氧化应激指标的测定采用南京建成试剂盒测定脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)。4脑组织Aβ测定采用天津九鼎医学生物工程有限公司Aβ放射免疫分析试剂盒,测定脑组织Aβ含量。5脑组织总游离脂肪酸测定采用南京建成的游离脂肪酸试剂盒,测定脑组织总游离脂肪酸含量。6脑组织基因mRNA表达的测定用Promega RNA提取试剂盒,提取脑组织总RNA。以18S rRNA做内参,real-time PCR测定APP、BACE1、ADAM10、PPARα、CPTⅠ、ACOX1、ACOX3、LBP、DBP、THLA、THLB和SCPx mRNA的相对表达量。7数据处理所有数据均用?x±s表示,采用SPSS 13.0软件进行统计学处理分析,对所测定结果进行正态性及方差齐性检验,单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组均与对照组比较,用两个独立样本T检验方法(双尾),检验以P < 0.05为差异有显著性意义。结果:1 OGTT试验以糖耐量曲线下面积(AUC)(mmol/L*h)表示。对照组为27.8217±1.2713,高脂喂养组为31.1383±1.7971。高脂喂养组与对照组相比,AUC明显增加(P < 0.01)。表明,胰岛素抵抗模型成立。2血糖、血胆固醇的变化2.1血糖(mmol/L)对照组为5.1417±0.5665,单纯胰岛素抵抗组为5.9533±1.7565,糖尿病组为12.7167±1.8622。糖尿病组与对照组相比,血糖增加(P < 0.01),单纯胰岛素抵抗组与对照组相比差别无统计学意义(P > 0.05)。表明,糖尿病模型成立2.2血胆固醇(mmol/L)对照组为1.6208±0.3274,单纯胰岛素抵抗组为1.4633±0.3734,糖尿病组为1.8750±0.8560。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比差别均无统计学意义(P > 0.05,P > 0.05)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠血中胆固醇水平没有变化。3脑组织氧化应激状态的变化3.1丙二醛(MDA)含量(nmol/mg prot)对照组为2.5817±0.4977,单纯胰岛素抵抗组为3.2199±0.5641,糖尿病组为3.6422±0.7434。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比,MDA含量增加(P < 0.05,P < 0.05)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,脂质过氧化产物增加,氧化应激增加。3.2总抗氧化能力(T-AOC)(U/mg prot)对照组为4.5899±0.4064,单纯胰岛素抵抗组为2.7492±0.2170,糖尿病组为2.6994±0.2811。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比T-AOC明显降低(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中清除活性氧的能力下降。3.3超氧化物岐化酶(SOD)活性(U/mg prot)对照组为189.1895±19.8206,单纯胰岛素抵抗组为168.5015±14.3083,糖尿病组为157.6365±16.7645。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比T-SOD活性明显降低(P < 0.05,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,清除超氧阴离子自由基的能力下降。3.4谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性(U/mg prot)对照组为70.9901±15.1047,单纯胰岛素抵抗组为50.6992±8.7335,糖尿病组为51.8568±13.2662。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比GSH-PX活性明显降低(P < 0.01,P < 0.05)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中清除过氧化氢的能力下降。3.5过氧化氢酶(CAT)活性(U/mg prot)对照组为8.6647±0.6612,单纯胰岛素抵抗组为7.3753±0.4180,糖尿病组为7.7356±0.6930。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比CAT活性明显降低(P < 0.01,P < 0.05)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中清除过氧化氢的能力下降。4脑组织Aβ含量(ng/mgprot)对照组为0.6675±0.1249,单纯胰岛素抵抗组为1.1024±0.1767,糖尿病组为1.1613±0.0990。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比脑组织Aβ含量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中Aβ含量增加。5脑组织总游离脂肪酸含量(mmol/g prot)对照组为0.6256±0.1174,单纯胰岛素抵抗组为0.9705±0.1973,糖尿病组为0.8387±0.1146。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比脑组织总游离脂肪酸含量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,在单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中脂肪酸含量增加。6脑组织待测基因mRNA的相对表达量的变化6.1 APP mRNA的相对表达量对照组为1.7853±0.2472,单纯胰岛素抵抗组为2.9749±0.1577,糖尿病组为2.6451±0.2418。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比APP mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,Aβ的增多可能与APP mRNA相对表达量增加有关。6.2β-分泌酶(BACE1)mRNA的相对表达量对照组为3.2275±0.1456,单纯胰岛素抵抗组为5.2675±0.9458,糖尿病组为5.4507±0.8602。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比BACE1 mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,Aβ的增多可能与APP的β-分泌酶裂解途径上调有关。6.3α-分泌酶(ADAM10)mRNA的相对表达量对照组为5.3933±0.5424,单纯胰岛素抵抗组为5.8163±0.9998,糖尿病组为5.9193±0.9344。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比差别均无统计学意义(P > 0.05,P > 0.05)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,APP的α-分泌酶裂解途径没有发生明显改变。6.4 PPARαmRNA的相对表达量对照组为2.9033±0.5425,单纯胰岛素抵抗组为3.7475±0.3225,糖尿病组为4.4925±0.6161。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比PPARαmRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,调节脂肪酸代谢的PPARαmRNA相对表达量增加。6.5 CPTⅠm RNA的相对表达量对照组为4.3467±0.4359,单纯胰岛素抵抗组为7.1600±0.7399,糖尿病组为7.5525±0.8917。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比CPTⅠm RNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。表明,单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠脑中,线粒体长链脂肪酸β氧化可能是增强的。6.6过氧化物酶体直链脂肪酸β氧化相关基因mRNA的相对表达量6.6.1 ACOX1mRNA的相对表达量对照组为20.8267±2.0094,单纯胰岛素抵抗组为28.5100±3.5548,糖尿病组为28.0925±4.6149。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比ACOX1mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。6.6.2 LBPmRNA的相对表达量对照组为2.4683±0.3750,单纯胰岛素抵抗组为3.8850±0.4841,糖尿病组为5.2943±0.8613。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比LBP1mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。6.6.3 THLA mRNA的相对表达量对照组为1.0850±0.2748,单纯胰岛素抵抗组为1.5733±0.2375,糖尿病组为1.2723±0.2521。单纯胰岛素抵抗组与对照组相比THLA mRNA相对表达量明显升高(P <0.01),糖尿病组与对照组相比差别无统计学意义(P > 0.05)。6.6.4 THLB mRNA的相对表达量对照组为1.7267±0.2225,单纯胰岛素抵抗组为2.0200±0.3703,糖尿病组为1.4867±0.0954。糖尿病组与对照组相比THLB mRNA相对表达量降低(P < 0.05),单纯胰岛素抵抗组与对照组相比差别无统计学意义(P > 0.05)。6.6.1-6.6.4的结果表明:单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠,脑过氧化物酶体中经上述酶催化的直链脂肪酸β氧化可能是增强的。6.7过氧化物酶体支链脂肪酸β氧化相关基因mRNA的相对表达量6.7.1 ACOX3 mRNA的相对表达量对照组为8.7500±0.4312,单纯胰岛素抵抗组为11.1775±2.1998,糖尿病组为12.1800±1.1681。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比ACOX3 mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。6.7.2 DBP mRNA的相对表达量对照组为14.1367±1.4650,单纯胰岛素抵抗组为19.0575±2.2587,糖尿病组为18.3650±3.5966。单纯胰岛素抵抗组和糖尿病组与对照组相比DBP mRNA相对表达量明显升高(P < 0.01,P < 0.01)。6.7.3 SCPx mRNA的相对表达量对照组为9.4433±1.0632,单纯胰岛素抵抗组为10.6500±1.1963,糖尿病组为7.0000±1.0379。糖尿病组与对照组相比SCPx mRNA相对表达量明显降低(P < 0.01),单纯胰岛素抵抗组与对照组相比SCPx mRNA相对表达量升高(P < 0.05)。6.7.1-6.7.3的结果表明:单纯胰岛素抵抗和糖尿病大鼠,脑过氧化物酶体中经上述酶催化的支链脂肪酸β氧化可能是增强的。结论:1单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病时,脑中已存有引起认知障碍的三大危险因素:氧化应激增加,Aβ增多,以及脂肪酸增多。2单纯胰岛素抵抗和2型糖尿病时,脑中氧化应激的增加与脂肪酸β氧化增强以及抗氧酶活性下降有关;脑中线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β氧化的增强,与脂肪酸代谢相关基因的转录水平增加有关,但不足以分解脑中蓄积的大量脂肪酸;Aβ的增多与APP、β-分泌酶转录水平增加有关。