电泳中介微分析及其在生化分析中的应用

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电泳中介微分析技术(EMMA)是在毛细管电泳基础上发展起来的,基于各反应物、产物在高压电场作用下迁移速率不同,在一根毛细管内完成试剂的混合和反应,随后产物和反应物在毛细管内被分离为独立的区带至检测器被检测。EMMA既包含了毛细管电泳(CE)高效分离的特性,也融合了流动注射分析(FIA)自动化的优点,它的出现为分析化学的发展提供了新契机,也为微流控分析技术(μ-TAS)提供了一种新思路。EMMA突出优点如下:第一,分析物和试剂的混合是在电场作用下的电泳混合,无额外稀释和区带展宽效应;第二,混合、反应、分离甚至检测均集成于封闭的毛细管内,不仅提高了分析效率,避免外界污染,而且可用于短寿命反应产物的检测以及快速反应动力学的研究;第三,样品和试剂用量极少,可大大降低分析成本,特别适合于细胞间液、单细胞等生化分析;第四,便于自动化、小型化,因此可基于此技术研制床旁(point-of-care)医检仪器等。 因电泳中介微分析具有上述优点,自从它诞生以来引起分析工作者的广泛关注,现已用于酶(包括酶基体、酶的激动剂和抑制剂等)分析、柱内衍生、小分子测定等诸多领域。本实验室利用EMMA技术中的区带-区带模式了测定了简单金属离子Fe2+和Cu2+以及两种酶,利用连续模式测定了食品中的氨基酸的并研究了环糊精与药物的包合作用等。 本文主要做了以下五个工作:1、电泳中介微分析法测定铁(Ⅱ)和铜(Ⅱ)利用电泳中介微分析通过与邻菲罗啉的络合反应完成了对Fe2+和Cu2+的同时测定。在压差作用下,淌度较小的邻菲罗啉在金属离子区带之前首先进样,加高电压后,两区带电泳在磷酸缓冲液中(pH=4.5)混合、反应形成络合物并实现电泳分离。研究了缓冲液pH、试剂和样品区带长度对分离效果的影响。对于Fe2+和Cu2+两离子,方法的检测限(S/N=3)分别为1.6and11μmol/L,线性范围分别为5.0×10-6-3.0×10-4mol/L(r=0.9979)和8.0×10-5-3.0×10-4mol/L(r=0.9996)。采用标准矿样验证了测定Fe2+的可行性。 2、电泳中介微分析法测定超氧化物歧化酶基于超氧化物歧化酶(SOD)对邻苯三酚自氧化的抑制作用和电泳中介微分析(EMMA)技术建立了一种测定SOD的新方法。采用“三明治”式不同pH缓冲液部分填充法,一方面有利于邻苯三酚的自氧化反应,便于观察SOD的抑制作用,另一方面则有利于反应产物与反应物的分离。对溶液填充模式、反应条件等实验参数进行了优化。结果表明在最优条件下,邻苯三酚自氧化反应的抑制率I与SOD浓度C在1.00×102-6.00×102μg/L范围内里良好的线性关系,回归方程为:I(%)=0.0895C(μg/L)+17.633(r=0.9973)。 3、电泳中介薇分析技术对胰凝乳蛋白酶的研究基于胰凝乳蛋白酶对N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(L-BTEE)的水解作用和电泳中介微分析(EMMA)技术建立了一种测定胰凝乳蛋白酶的新方法,采用区带-区带(Plug-plug)模式,对酶的活性及米氏常数进行了测定,并考察了金属离子Ca2+(激活剂)和Cu2+、Ni2+(抑制剂)对酶活性的影响。催化前后产物吸光度相对标准偏差(RSD)分别为2.34%和3.46%。 4、毛细管电泳间接紫外检测酱油中的游离氨基酸以三羟甲基氨基甲烷(Tris)(pH=10.50)为缓冲液,苯甲酸为背景电解质,利用毛细管电泳-间接紫外检测方法分离测定了酱油中的丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸及天冬氨酸。在优化条件下,上述六种氨基酸于5min内实现了基线分离,各物质吸光度的相对标准偏差(RSD)均小于5%。线性范围为10-1000μmol/L,检测限(S/N=3)分别为2.0,3.5,4.0,5.0,3.5,5.0μmol/L,六种氨基酸的加标回收率均在95.9%~104.2%范围内。 5、毛细管电泳法研究环糊精与芦丁和氯霉素的相互作用基于毛细管电泳淌度移动法,同时测定了β-环糊精与芦丁和氯霉素在硼酸缓冲液(pH=8.6)中的包合常数及包合反应的热力学参数。在优化后的测定条件下,25℃时测得芦丁和氯霉素与β-CD的包合常数分别为98.5和1204L/mol,结果与文献值相当。两包合反应的焓熵互补现象明显,探讨了包合反应的机理,并采用MM2力场对β-CD与两种药物分子包合物的稳定构型进行了分子力学模拟,结果与实验相符。
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