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研究背景：
帕金森病是一种常见的老年神经变性病。临床上PD主要表现为静止性震颤、运动迟缓和肌张力增高，病理上则表现进行性中脑多巴胺(Dopamine，DA)神经元的变性和缺失，伴细胞内路易小体(Lewy body，LB)形成。目前治疗PD的主要手段仍为多巴胺替代疗法，但并不能延缓或阻止PD的进程。随着疾病的发展，众多的PD患者在发病的10到15年内出现明显残障，造成了巨大的经济和社会负担。因此，人们开始调整思路寻求新疗法，以在增强多巴胺系统的功能的同时，保护多巴胺神经元，从而达到延缓或阻止疾病发展的目的。
PD的病因及发病机制仍未清楚。普遍认为UPS功能障碍，氧化应激，铁离子浓度增高，线粒体功能不全等都参与了PD的发病过程。研究发现系统注射蛋白酶体抑制剂能通过抑制大鼠中脑的蛋白酶诱导大鼠出现PD症状。中脑铁离子浓度增高能引起和加剧氧化应激，导致DA能神经元死亡，因此，螯合过多的游离的铁离子一直被认为是治疗PD的可行性方案之一。不少研究者证明了铁螯合剂如去铁胺等，能有效地保护黑质纹状体环路，缓解PD动物模型的症状。因此本研究将以蛋白酶体抑制剂诱导的PD小鼠模型为基础，深入研究铁螯合治疗PD的可行性和作用机理，为进一步开发、应用铁螯合剂提供线索和依据。
研究目的:
1.在体研究新型铁螯合剂VK-28对lactacystin诱导的PD小鼠的保护作用及相关机制．
2.在体研究过表达人铁蛋白重链对lactacystin诱导的PD小鼠的保护作用及相关机制。
方法和结果:
第一部分在体研究新型铁螯合剂VK-28对lactacystin所致PD小鼠的保护作用方法1.Lactacystin诱导PD小鼠模型的制作
2.动物分组正常对照组：双侧立体定向注射1.25μl PBS至小鼠MFB，腹腔注射生理盐水，共设20只，术后28天处死。
Lactacystin组(Lac)：双侧各立体定向注射1.251μl lactacystin(1mg／ml)至小鼠前脑内侧束(MFB)，腹腔注射生理盐水，共设30只，手术后7天处死10只，其余术后28天处死。
Lactacystin+VK-28预处理组(Pre-VK-28):先VK-28腹腔注射7天(按每公斤体重5mg，每天一次)，双侧各立体定向注射1.25μl lactacystin(1mg／ml)至小鼠MFB，继续腹腔注射28天，术后28天处死，共设20只；
Lactacystin+VK-28后处理组(Post-VK-28)：立体定向注射1.25μllactacystin(1mg／ml)至小鼠MFB，术后7天开始腹腔注射VK-28(按每公斤体重5mg，每天一次)，术后28天处死，共设20只。
3.动物行为学观察
4.TH、CD11b、ubiquitin及α-Synuclein染色结果观察
5.高效液相色谱(HPLC)检测纹状体DA及其代谢产物含量。
6.生化检测蛋白酶体的活性和中脑铁离子的含量。
7.WesternBlot检测Bcl-2的表达水平
结果:1.VK-28改善Lactacystin诱导的运动障碍术前各组小鼠自主活动和爬杆的指标无统计学差异。立体定向注射术后7天，Lac组小鼠活动能力较正常对照组明显下降。Pre-VK-28组小鼠较Lac组有所改善，两组差别有计学意义(P<0.01)。术后28天，Pre-VK-28组小鼠和Post-VK-28组小鼠自主活动和爬杆能力与Lac组小鼠相比均有所提高，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。
2.VK-28降低Lactacystin诱导的DA能细胞死亡各组均检测到TH的阳性细胞表达。立体定向注射术后7天，Lac组TH阳性细胞与正常对照组减少约20％(P<0.05)。术后28天，Lac组TH阳性细胞较正常对照组细胞减少，残余细胞内可见ubiquitin或α-Synuclein阳性包涵体。Pre-VK-28和Pos-VK-28组的TH阳性细胞数量均较Lac组多(P<0.01)。
3.VK-28提高Lactacystin小鼠纹状体DA的含量立体定向注射术后7天，Lac组小鼠纹状体内DA含量与正常对照组相比减少约15.5％(P<0.05)。术后28天，Lac组小鼠纹状体内含量较正常对照组进一步减少，Pre-VK-28组和Post-VK-28组小鼠纹状体内含量DA的含量均较Lac组多(P<0.01)。
4.VK-28对Lactacystin诱导胶质细胞激活的影响正常对照组Mic呈现典型的“分枝样”，40×光镜视野下鲜见。立体定向注射术后7天，Lac组小鼠黑质部位可见大部分Mic活化，胞体增大，突起变短、增粗，细胞数量明显增多(P<0.01)。术后28天，Mic的活化减轻，细胞数量减少，部分细胞恢复至“分枝样”。Pre-VK-28和Post-VK-28组小鼠黑质中的Mic数目较单纯LPS组明显减少(P<0.01)，且主要成“分枝样”。
5.VK-28改善Lactacystin小鼠中脑蛋白酶体的活性立体定向注射术后7天，Lac组小鼠中脑的蛋白酶体活性较正常对照组降低(P<0.01)。术后28天，Lac组小鼠中脑蛋白酶体活性与正常对照组相比无提高(P>0.05)。Pre-VK-28组和Post-VK-28组小鼠中脑的蛋白酶体活性较Lac组比均有明显改善(P<0.05)。
6.VK-28降低Lactacystin小鼠中脑的铁含量。
立体定向注射术后7天，Lac组小鼠中脑的铁含量较正常对照组无明显改变。但术后28天，Lac组小鼠中脑的铁含量与正常对照组相比升高32.7％(P<0.05)。与Lac组相比，Pre-VK-28组和Post-VK-28组小鼠中脑的铁含量明显降低(P<0.05)，与正常对照组小鼠中脑的铁含量相仿。
7.VK-28对Lactacystin小鼠中脑Bcl-2蛋白的表达Western检测小鼠中脑的Bcl-2蛋白表达水平发现，立体定向注射术后7天，Lac组小鼠中脑的Bel-2蛋白水平明显下降(P<0.01)，术后28天该蛋白水平稍有回升，为正常对照组的22％，Pre-VK-28组和Post-VK-28组小鼠中脑Bcl-2蛋白的水平与Lac组相比无显著提高(P>0.05)。
第二部分在体研究过表达人铁蛋白重链对lactacystin所致PD小鼠的保护作用
方法:1.立体定向注射lactacystin制作PD动物模型。
2.动物分组
野生型对照组(Wt-PBS)：野生型B6D2小鼠双侧MFB立体定向注射1.25μlPBS，共设20只野生型Lactacystin组(Wt-Lac)：野生型B6D2小鼠双侧MFB各立体定向注射1.25μl Lactacystin(1mg／ml)，共设20只人铁蛋白重链转基因鼠对照组(Tg-PBS):人铁蛋白重链转基因鼠双侧MFB立体定向注射1.25μl PBS，共设20只;
人铁蛋白重链转基因鼠lactacystin组(Tg-Lac)：人铁蛋白重链转基因鼠双侧MFB立体定向注射1,25μl Lactacystin(1mg／ml)，共设20只所有动物于立体定向术后28天处死。
3.免疫组化检测TH和CD11b阳性细胞的数量。
4.HPLC检测纹状体DA含量。
5.生化检测蛋白酶体的活性和中脑铁离子的含量。
6.免疫印迹检测铁蛋白、转铁蛋白、铁调控蛋白1／2等铁相关蛋白的表达水平。
结果:
1.人铁蛋白重链转基因小鼠基因型的鉴定及人铁蛋白重链在小鼠中脑的表达转基因小鼠的PCR产物可见-500bp的特异扩增条带，但野生型小鼠无特异条带扩增。相应的，western blot检测，转基因小鼠的中脑能见人铁蛋白重链的蛋白表达，而野生型小鼠则无该蛋白表达。
2.过表达人铁蛋白重链延缓lactacystin诱导的黑质TH阳性神经元死亡立体定向术后28天，Wt-Lac组小鼠黑质的TH阳性神经元数目较其对照组明显减少(P<0.01)，为对照组的70％。而与其对照组相比，Tg-Lac组小鼠的TH阳性神经元数目仅下降9％。
3.过表达人铁蛋白重链减轻lactacystin诱导的纹状体DA含量下降与TH阳性细胞减少相平行，立体定向术后28天，Wt-Lac组小鼠纹状体DA含量下降至其对照组的68.9％(P<0.01)，同时DOPAC亦下降至对照组的71.5％(P<0.01)。而人铁蛋白重链转基因小鼠能较好地耐受lactacystin诱导的中脑-纹状体DA能通路的损伤，Tg-Lac组小鼠与其对照组相比，纹状体DA和DOPAC的含量分别只下降8.5％和12.4％。
4.过表达人铁蛋白重链抑制lactacystin诱导的小胶质细胞活化立体定向注射术后28天，Wt-Lac组小鼠的中脑仍见明显的小胶质细胞聚集，细胞体较大，部分成吞噬状，染色较深。相比之下，Tg-Lac组小鼠中脑小胶质细胞数量稀少，胞体小，呈分枝样。
结论:
1.双侧立体定向注射lactacystin能诱导稳定的PD小鼠模型。
2.新型铁离子螯合剂VK-28拮抗lactacystin诱导的黑质纹状体通路的退行性变，起到神经保护的作用。
3.过表达人铁蛋白重链同样能保护黑质纹状体通路，拮抗lactacystin诱导的神经毒性作用。