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目的在供肝资源稀缺、无血型相合供肝的情况下,急诊ABO血型不合肝移植是挽救急性肝功能衰竭患者生命的有效手段。但传统的血型不合肝移植围手术期免疫抑制方案过于复杂,需要术前数周开始进行特殊的准备,不适用于急诊肝移植及危重症患者。因此,我们探索并尝试了一种简化的围手术期跨越血型屏障方案(以利妥昔单抗和免疫球蛋白为基础,不采用血浆置换、脾脏切除和肝脏灌注),观察其是否可以有效预防血型不合肝移植术后发生血型抗体介导的排斥反应；并通过与同期开展的血型相合肝移植治疗急性肝衰竭病例在生存率、并发症等各方面进行比较,探讨其在急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭中应用的可行性、有效性和安全性。同时,我们还尝试通过动物实验建立ABO血型不合肝移植受者人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型,以供体血型红细胞抗原致敏,检测小鼠血型抗体水平,以此来验证并阐明ABO血型不合肝移植术后可以产生针对供体血型抗原的特异性免疫耐受。并通过比较健康人群、血型不合患者术后早期和术后晚期的CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞水平,初步探讨了调节性B细胞在血型抗原特异性免疫耐受中可能发挥的作用。材料与方法第一部分：急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭---利妥昔单抗联合免疫球蛋白简化方案的应用1.病人资料：分析2010年1月-2013年7月,我中心(浙江大学医学院附属第一医院肝移植中心)共为101例急性肝衰竭患者进行急诊肝移植治疗(尸体供肝),血型相合组66例,血型不合组35例；2.围手术期免疫抑制方案：血型不合组患者手术当天使用1剂利妥昔单抗(375mg/m2),免疫球蛋白手术当天开始使用并连续使用10天(0.4g/kg*10d)。两组术后基础免疫抑制方案包括巴利昔单抗、肾上腺糖皮质激素、他克莫司和吗替麦考酚酯；3.术后抗感染治疗方案；4.他克莫司血药浓度检测：酶联免疫吸附分析法；5.血型不合组患者围手术期抗供体血型抗体(IgM)效价检测：盐水稀释法；6.血型不合组患者围手术期CD20+B淋巴细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术；7.统计学分析：所有统计分析均使用SPSS17.0统计软件包进行统计学处理。连续变量以平均数和标准差描述,非连续变量以数字和百分比描述,以Students’t检验或卡方检验比较组间差异。患者累积生存率与移植肝存活率使用Kaplan-Meier法统计,组间生存曲线比较使用log-rank检验。P<0.05为差异有统计学意义。第二部分：ABO血型不合肝移植诱导供体血型抗原特异性免疫耐受的实验研究1.研究对象基本数据：2例接受ABO血型不合肝移植长期生存受者作为实验组,并根据其供受者血型设立相应阳性对照与阴性对照,共6例研究对象。分别编号为1A(血型不合受者AB→A),阳性对照1B(血型相合受者A→A),阴性对照1C(血型相合受者AB→AB);2A(血型不合受者AB→),阳性对照2B(血型相合受者O→O),阴性对照2C(血型相合受者AB→AB)。另入组18例健康志愿者和6例血型不合肝移植术后早期受者作为CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测的对照组；2.主要试剂及其配方；3.主要仪器与设备；4.血型不合受者(1A、2A)外周血抗供体血型抗体(IgM)检测：盐水稀释法；5.人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)的分离：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法,(1A、1B、1C、2A、2B、2C);6. NOD/SCID小鼠饲养；7.构建人PBMC-NOD/SCID小鼠嵌合体模型及红细胞致敏：第一天,PBMCs腹腔注射小鼠；第五天,AB型红细胞免疫小鼠；第十四天,获取小鼠血清；8. PBMC-NOD/SCID嵌合小鼠血型抗体(IgM)检测：酶联免疫吸附分析法；9.健康志愿者、血型不合肝移植术后早期受者和术后长期存活受者(1A、2A)外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞检测：直接免疫荧光标记流式细胞术；10.统计学分析：用SPSS17.0软件计算各组数据的平均数和标准差。用Students’t检验比较组间差异。p<0.05为差异有统计学意义。结果第一部分1.两组患者肝移植术前基本资料比较无统计学差异；2.两组患者肝移植术后他克莫司血药浓度比较无统计学差异；3.血型不合组供受者血型为AB→O最常见,占34%；4.血型不合组患者术前抗供体血型抗体(IgM)效价1：4-1：1024(平均1：192),术后迅速下降,术后第1天和第7天分别为1：1-1：32(平均1：16)和1：4-1：128(平均1：28),并在术后数月维持较低水平。CD20+B淋巴细胞计数在术后迅速下降至小于1%并维持数月；5.血型不合组共发生2例(5.7%)抗体介导的排斥反应(antibody-mediated rejection, AMR),术前抗体效价1：8-1：64,术后2周左右上升至1：256-1：512,分别表现为肝脏多发坏死和肝内胆管并发症,1例经血浆置换和免疫球蛋白治疗好转,1例治疗无效后于术后6月接受再次肝移植；6.血型不合与血型相合组患者3年累积生存率分别为83%与86%(lok-rank, p=0.596),两组移植肝3年存活率分别为80%与86%(lok-rank,p=0.417),无统计学差异；7.血型不合与血型相合组患者术后并发症(感染、排斥反应、胆道并发症、血管并发症、腹腔出血、肾功能不全、颅内出血、移植物抗宿主病等)发生率比较无统计学差异。第二部分1.血型不合受者抗供体血型抗体(IgM)效价：受者1A(血型不合AB→A)外周血抗B IgM长期维持较低水平甚至测不出0-1：4；受者2A(血型不合AB→O)外周血抗A和抗B IgM长期维持较低水平甚至测不出：抗A效价1：1-1：4,抗B效价0-1：4；2. PBMC-NOD/SCID嵌合小鼠血型抗体(IgM) ELISA测定：受者1A(血型不合AB→A)嵌合小鼠接受AB型红细胞刺激后,测抗B OD值为0.09,明显低于阳性对照组(1B),与阴性对照组(1C)比较无明显差异；受者2A(血型不合AB→O)嵌合小鼠接受AB型红细胞刺激后,测抗A和抗B OD值分别为0.08和0.07,明显低于阳性对照组(2B),与阴性对照组(2C)比较无明显差异；3.外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞比例：两例血型不合受者1A和2A术后4年的外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞比例分别为5.95%和4.51%,明显高于健康人群和血型不合肝移植患者术后短期水平。结论1.以利妥昔单抗联合免疫球蛋白为基础的简化方案用于急诊ABO血型不合肝移植治疗急性肝衰竭安全有效,较传统方案更具可行性,AMR发生率低,增加了肝衰竭患者进行肝移植的机会,是在供体短缺、无血型相合供肝的情况下,挽救危重症肝衰竭患者生命的合适选择；2.ABO血型不合肝移植术后可以诱导产生针对供体血型抗原的特异性免疫耐受,CD19+CD24hiCD38hi调节性B细胞的免疫抑制功能可能参与了血型抗原特异性免疫耐受的发生。