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研究目的：1.观察不同盲肠结扎比例对小鼠脾脏调节性T细胞(Regulatory T cell, Treg, CD4+CD25+Treg)表面分子神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1)表达的影响。2观察不同浓度抗neuropilin-1干预对细菌脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)刺激的Treg表面分子neuropilin-1、膜相关转化性生长因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β)、T淋巴细胞毒性相关抗原-4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)和特征性活性标志物——叉头翼状转录因子-3(Forkhead box-p3transcription factor,Foxp3)表达的影响。3.观察不同浓度和不同时间抗neuropilin-1干预后的Treg对CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能、细胞凋亡及转录因子Smad2表达与磷酸化的影响。研究方法：1.将60只雄性BALB/c小鼠按照盲肠结扎长度在总盲肠中的比例分为轻度(结扎1/3)、中度(结扎1/2)和重度(结扎3/4)脓毒症组,分别制作盲肠结扎穿孔术(Cecal ligation and puncture,CLP)脓毒症模型；另外设置假伤组和对照组,每组各10只。分别于CLP24h后断颈处死,取脾脏分离CD4+CD25+Treg,通过FACS Calibur流式细胞分析仪检测细胞表面分子neuropilin-1和特征性活性标志物—-Foxp3的表达。2.分选正常雄性BALB/c小鼠脾脏CD4+CD25+Treg后,分为正常细胞对照组、抗CD3/CD28组、不同浓度LPS(10、100、1000ng/ml)+抗CD3/CD28组；另外分离脾脏CD4+CD25+Treg后,分为对照组、抗CD3/CD28组、LPS(100ng/ml)+抗CD3/CD28组和LPS+抗CD3/CD28+不同浓度纯化的抗小鼠／大鼠neuropilin-1组(0.5、5、10μg/ml),分别于培养24h后收集细胞通过FACS Calibur流式细胞分析仪检测细胞表面分子neuropilin-1、膜相关TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表达。3.小鼠脾脏CD4+CD25+Treg分别用纯化的抗小鼠/大鼠neuropilin-1(0.5、5、10μg/ml)预先封闭1h后,在抗CD3/CD28和LPS诱导下,分别按照细胞数比例为1：1与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养；并设正常CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞对照组。分别培养12h、24h、48h后,通过Spectra MR全功能酶标仪检测CD4+CD25-T淋巴细胞增殖功能、FACS Calibur流式细胞分析仪检测CD4+CD25-T淋巴细胞凋亡和Western blot分析Smad2表达与磷酸化。研究结果：1.与对照组和假伤组比较,CLP24h内随着盲肠结扎比例增加,生存率逐渐降低(P<0.01)；Foxp-3表达率随着盲肠结扎比例的增加逐渐升高,各组之间有显著统计学意义(P<0.01)；与轻度脓毒症组比较,中-重度脓毒症组脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表达率明显升高,具有显著统计学意义(P<0.01),中度脓毒症组脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1表达率已经达到最高,与重度脓毒症组比较无统计学意义(P>0.05)。2.与对照组或抗CD3/CD28组比较,小鼠脾脏CD4+CD25+Treg表面分子neuropilin-1、膜相关TGF-β、CTLA-4和Foxp-3表达随着LPS浓度的增加,逐渐增强,其中中浓度LPS刺激已经达到最大效能(P<0.05或0.01)；与LPS+抗CD3/CD28组比较,neuropilin-1和膜相关TGF-p表达随着抗体浓度的升高,其表达率逐渐下降,各组间有统计学意义(P<0.05),而抗neuropilin-1干预不能改变CD4+CD25+Treg表面分子CTLA-4和Foxp-3表达,无统计学意义(P>0.05)。3.与对照组比较,抗CD3/CD28刺激12h后便能够促进小鼠脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05)；与LPS+抗CD3/CD28组比较,CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞共培养12h后,未经抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg便开始抑制CD4+CD25-T细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.05),但随着抗体浓度的增加,其抑制作用逐渐减弱,具有明显的浓度依赖性,其中5μg/ml组作用已经最为明显(P<0.05)；与LPS+抗CD3/CD28组比较,CD4+CD25+Treg和CD4+CD25-T淋巴细胞共培养12h后,未经抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg便开始促进CD4+CD25-T细胞凋亡,但差异无统计学意义(P>0.05),而24h后,CD4+CD25-T细胞凋亡率进一步增加,差异有显著统计学意义(P<0.01),同时CD4+CD25+Treg经5μg/ml抗neuropilin-1封闭后能够明显抑制其促进CD4+CD25-T淋巴细胞凋亡的作用,凋亡率明显降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)；以β-actin作为内参,Western blot定性分析体内实验各组脾脏CD4+CD25-T淋巴细胞内Smad2和磷酸化-Smad2(Phospho-Smad2,P-Smad2)表达发现：对照组、假伤组和轻度脓毒症组Smad2和P-Smad2表达无明显区别,而中-重度脓毒症组Smad2和P-Smad2表达量明显增加；体外实验进一步表明未经5μg/ml抗neuropilin-1封闭的CD4+CD25+Treg与CD4+CD25-T淋巴细胞共培养48h后能够明显增加Smad2和P-Smad2的表达,同时经5μg/ml抗neuropilin-1封闭后能够逆转这一作用。研究结论：1.盲肠不同结扎比例是脓毒症小鼠死亡的危险因素之一,Treg活性随着盲肠结扎比例的增加逐渐增强,其细胞表面分子neuropilin-1表达亦明显增强。2.LPS刺激能够促进Treg表面分子neuropilin-1、CTLA-4、膜相关TGF-β和特征性标志物Foxp3表达,随着抗neuropilin-1浓度的增加膜相关TGF-β、表达逐渐减弱,而对CTLA-4、Foxp3表达无影响。3.Treg表面分子neuropilin-1通过影响膜相关TGF-β介导的免疫抑制机制参与Treg免疫负向调控作用。