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第一部分：神经母细胞瘤中肿瘤恶液质的研究 目的：神经母细胞瘤(neuroblastoma，N B )是儿童最常见的颇外实体肿瘤，占儿童肿瘤的10%和儿童肿瘤相关死亡的15%。肿瘤恶液质（cancer cachexia，CC)是常见的伴随肿瘤发生的多因素综合征，主要表现为体重减轻、骨骼肌减少。大约50% 的肿瘤患者的死亡与肿瘤恶液质相关，为探究神经母细胞瘤患者肿瘤恶液质的发生机制，我们尝试建立神经母细胞瘤恶液质模型：KP-N-NS神经母细胞瘤模型，并初步探索其发生机制。 方法：1、体内实验：将 1 2只裸鼠随机分为两组，KP-N-NS组 6只裸鼠皮下注射KP-N-NS细胞，P B S组6只裸鼠皮下注射等体积PBS; 之后监测裸鼠体重及摄食重量，6周后处死存活裸鼠，收集裸鼠骨骼肌、心脏标本，用H&E染色方法观察裸鼠骨骼肌、心肌的变化，用免疫荧光方法检测骨骼肌中肌球蛋白（M yosin)表达水平,用免疫组化方法检测裸鼠骨骼肌中增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。2、体外实验:收集培养过KP-N-NS细胞的培养基作为条件培养基(conditioned medium，C M ),用CM (CM 组）、Angiogenin (血管生成素） （Angiogenin组）培养C2C12细胞，用正常培养的C2C12细胞作为对照组，观察细胞数量及生存状态。诱导C2C12细胞分化3d，用CM、Angiogenin培养C2C12细胞24h，用免疫荧实验观察C2C12细胞肌管直径变化。用C M培养C2C12细胞15min、30min、lh、2 4 h ,提取相应蛋白质，用Western Blot方法检测增殖、自噬、泛素化相关蛋白表达水平。用蛋白芯片方法检测CM中细胞因子表达变化。 结果：KP-N-NS移植瘤裸鼠存活率下降，体重减轻，摄食减少，骨骼肌、心脏受累，骨骼肌Myosin表达下降，Fbxo32表达升高，成功建立KP-N-NS神经母细胞瘤恶液质模型。用C M处理后C2C12细胞数量减少，肌管直径减小，Stat3磷酸化水平升高，Akt、m T O R磷酸化水平下降。C M 中 Angiogenin表达水平明显升高。Angiogenin处理后C2C12细胞数量减少，肌管直径减小。 结论：成功构建了 KP-N-NS细胞诱导裸鼠的恶液质模型，肿瘤恶液质状态下，Angiogenin、Myosin、Fbxo32、Stat3、Akt、mTOR 的表达水平明显异常，体外共培养实验显示Angiogenin可以导致细胞出现恶液质样改变。 第二部分：PLK1抑制剂R03280诱导神经母细胞瘤凋亡及自噬的研究 目的:Pololike激酶1(PLK1)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在包括神经母细胞瘤在内的许多肿瘤中过表达。PLK1抑制剂R03280已被证明可以抑制白血病细胞的细胞生长。然而，R03280对神经母细胞瘤的可能作用尚未见相关报道，本研究的目的是探索R03280对神经母细胞瘤细胞的作用。 方法:用 C C K-8和集落形成实验检测神经母细胞瘤细胞生长情况，用 Annexin V/PI染色和流式细胞术测定细胞凋亡和细胞周期，用荧光共聚焦显微镜和透射电镜检测细胞自噬，对Western B lo t检测多种细胞凋亡和自噬相关蛋白表达情况，用PCR对神经母细胞瘤细胞的基因表达谱进行分析。 结果:R03280以浓度依赖性的方式抑制神经母细胞瘤细胞的生长，R03280处理后的神经母细胞瘤细胞细胞周期发生G 2/M期阻滞，细胞凋亡比例增加，LC3-GFP荧光斑点和自噬体明显增多，分割PARP和Caspase-3增高，LC3-II表达升高，细胞凋亡、自噬相关基因的表达水平也发生相应改变。 结论:R03280通过诱导细胞凋亡和自噬，抑制神经母细胞瘤细胞的生长。