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腹膜透析(Peritoneal dialysis,PD)是肾脏替代治疗的一种方法,因其对患者残存肾功能的独特保护优势,已成为部分终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的首选治疗方式。腹膜纤维化(peritoneal fibrosis,PF)是患者退出腹膜透析的重要原因,导致这种病理改变是多因素的,其中腹膜上皮细胞向间充质细胞的转分化(epithelial-mesenchymal-transitions,EMT)是PF的始动环节。前期研究表明,硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)可诱导腹膜间皮细胞发生EMT,转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)的参与可能起重要作用。但IS诱导的EMT过程中上皮细胞主要标志E-钙粘素(E-cadherin)是否发生变化未明确,且TGF-β1以及指蛋白Twist、Slug、ZEBl、ZEB2和E12/E47等多个转录因子有可能表现出对E-cadherin的转录抑制,本课题主要对IS导致EMT过程再进一步深入研究。【目的】(1)通过IS诱导人腹膜间皮细胞永生化细胞株(HMrSV5),检测细胞形态变化及E-钙粘素(E-cadherin)的变化,研究细胞转分化情况;(2)研究转化生长因子β1(TGF-β1)及Twist1分子在上述过程中的表达变化,探讨两者在腹膜间皮细胞发生EMT的作用,以及这三种因子可能存在的调节关系。【方法】通过对HMrSV5体外培养,进行传代,然后将HMrSV5分成5组:(1)IS处理组:用1000umol/L浓度的IS与培养液共培养;(2)PDF(peritoneal dialysis fluid,腹膜透析液)处理组:加4.25%腹膜透析液与培养液共培养;TGF-β1受体抑制剂(Transforming growth factor-βR1 inhibitor,TRI)组:(3)用含2umol/L LY364947+1000umol/l浓度的IS培养液共培养;(4)用含2umol/L LY364947+4.25%腹膜透析液与培养液进行培养;(5)只用培养液对细胞进行培养。用免疫荧光法观察细胞在0h、4h、24h、48h、72h的形态改变,用qRT-PCR方法测得各组各时间点TGF-β1、E-cadherin、Twist1基因相对表达量。【结果】(1)经IS剌激细胞后,细胞由铺路石样变细变长,并呈梭形改变。E-cadherin基因表达量成先上升后下降趋势,在细胞培养24小时后达峰值,随后逐渐减少,差异有统计学意义(P<0.05);(2)经IS/PDF刺激细胞48小时后TGF-β1表达量增加最明显,与对应的TRI组在24h、48h、72h时间点比较,差异显著,差异有统计学意义(P<0.05);(3)经IS/PDF刺激细胞48小时后Twist1表达量增加最明显,与对应的TRI组在24h、48h、72h时间点比较,差异显著,差异有统计学意义(P<0.05),且IS实验组E-cadherin和Twist1的基因表达呈负相关(R~2=0.3948)。【结论】(1)IS刺激下48h组大幅度减少腹膜间皮细胞E-cadherin的基因表达,结合前期研究结果IS可刺激腹膜间皮细胞α-SMA表达及FN(Fibronectin,纤维连接蛋白)、LN5(laminin5,层黏连蛋白)分泌增多,更进一步明确IS可诱导腹膜细胞发生EMT。(2)IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT的过程中,IS可促进TGF-β1的基因表达,而后者对E-cadherin基因表达有抑制作用。结合前期研究IS通过TGF-β1对α-SMA的促进作用,说明IS可通过增加TGF-β1基因表达来促进腹膜间皮细胞EMT。(3)IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT过程中,IS可促进twist1的基因表达,TGF-β1表达水平可调节对Twis-t1基因表达,结合Twist1在细胞转分化的作用,提示Twist1参与了IS诱导腹膜间皮细胞发生EMT过程。