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研究背景骨关节炎(Osteoarhritis,OA)是一种常见的慢性、退行性关节疾病,多是由于关节局部损伤、炎症或者长期慢性劳损、肥胖等原因引起,以疼痛、肿胀、活动障碍为主要症状。其病理改变主要是软骨退变并伴随关节腔内包括滑膜、关节囊、韧带等结构程度不一的炎症。软骨退变与关节腔内炎症坏境、金属蛋白酶的表达、细胞凋亡等都有一定的关系,是多方面综合作用的结果。其中,软骨退变与炎症坏境关系密切,研究表明,各种免疫细胞、促炎细胞因子、补体和免疫系统的其他部分参与OA的炎症过程,炎症环境会损害软骨细胞、破坏细胞外基质,促进软骨损伤退变,反过来软骨退变又进一步刺激炎症反应的发生。因此OA己被确定为免疫病理学疾病。OA的发展过程,就是滑膜细胞、软骨细胞的炎症活化过程,研究表明OA产生、进展过程与免疫系统参与并激活有关,先天性免疫系统和适应性免疫系统先后被激活,导致了炎症和OA的进一步发展,免疫系统的激活也引起VEGF、环氧合酶-2等细胞因子的释放及CD4+T细胞、巨噬细胞等免疫细胞的浸润增加,但究竟炎症过程是如何产生的,与免疫细胞之间存在什么联系,是由什么分子机制参与构成,目前尚没有明确的定论。程序性细胞死亡受体1(programmed cell death-1,PD-1)是表达于T淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞等细胞表面上的一种蛋白质,属于CD28超家族成员,参与小鼠免疫系统的控制,程序性死亡配体-1(programmed death-ligand 1,PD-L1)是PD-1的两种配体之一,是B7家族成员,可表达于巨噬细胞等多种免疫细胞和数种肿瘤细胞,作为一种负性协同刺激分子,与PD-1结合后可通过阻断磷酸化信号来抑制免疫细胞的活化,在多种疾病特别是自身免疫性疾病中发挥重要作用。当PD-1/PD-L1免疫检查点被抗体阻断后,免疫细胞可活化并增殖,释放炎症因子,促进体内炎症的发生。然而该免疫检查点是否参与OA中炎症过程的调节仍然是未知的,有关PD-1/PD-L1在OA中的作用及其机制研究,目前鲜有报道。研究目的本课题的目的是通过阻断PD-1/PD-L1免疫检查点通路,研究小鼠OA模型发生的变化,探讨该通路在OA中的作用及机制,希望为研究OA的发病机制探索新的研究方向,为临床治疗OA寻找新的靶点奠定理论基础。为了研究PD-1/PD-L1通路在小鼠OA中的作用及其机制,主要从以下几个方面进行了研究:1.阻断PD-L1免疫检查点在小鼠OA模型中的作用:通过建立OA小鼠模型,关节腔内注射抗PD-L1抗体,观察OA的严重程度变化,以说明该信号通路是否参与OA的发生;然后利用ELISA和Real time-PCR的方法检测关节滑液和滑膜组织中炎性细胞因子IL-6和TNF-α的水平,以说明PD-1/PD-L1通路通过调控IL-6和TNF-α的表达参与OA的发生。2.体外阻断PD-1/PD-L1通路介导的免疫反应在OA中的作用:通过对关节腔滑液中收集的免疫细胞用PD-L1抗体体外处理,观察培养上清中IL-6和TNF-α的水平变化是否与体内结果一致,以验证该通路对OA的作用;然后利用流式细胞仪对关节内的免疫细胞的种类进行分析,研究PD-1/PD-L1通路介导的免疫反应如何参与OA炎症反应的发生。3.探讨PD-1/PD-L1通路在小鼠OA中的作用机制:通过对正常小鼠骨髓巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDM)活化处理并检测其细胞因子的表达水平,将其注射到OA小鼠模型中,观察OA的软骨损伤程度变化情况,以研究巨噬细胞是否通过活化后分泌炎症因子IL-6和TNF-α导致OA的加重。然后分离的OA小鼠滑液中巨噬细胞并检测PD-L1水平,通过对巨噬细胞的抗PD-L1处理及腹腔内注射炎症因子抗体处理,观察OA软骨损害程度变化,以阐明PD-1/PD-L1通路在小鼠OA中的作用机制。研究方法1.阻断PD-L1免疫检查点在小鼠OA模型中的作用:通过注射胶原酶或前十字韧带横断(anterior cruciate ligament transection,ACLT)诱导小鼠 OA,关节内定期注射抗PD-L1抗体用于阻断PD-L1通路,对照组注射大鼠IgG同型对照。胶原酶诱导的OA模型4周后处死小鼠,ACLT诱导的小鼠OA模型10周后处死小鼠,膝关节组织切片用番红-O染色观察软骨组织的破坏程度,并通过组织学和 OA 国际研究协会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)评分对其软骨损伤程度进行评价。通过ELISA的方法检查炎症细胞因子(IL-6、TNF-α)的水平,并通过real time-PCR的方法检测细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β等)mRNA水平的表达。2.体外阻断PD-1/PD-L1通路介导的免疫反应在OA中的作用:收集小鼠OA模型关节腔滑液中的免疫细胞,体外用PD-L1抗体处理,用ELISA的方法检测培养上清中IL-6和TNF-α的水平。用流式细胞仪对关节腔滑液中免疫细胞进行分选,分别获得巨噬细胞和T细胞,分别用Western blot检测巨噬细胞和T细胞PD-L1抗体处理组与对照组IL-6和TNF-α蛋白水平的表达。3.探讨PD-1/PD-L1通路在小鼠OA中的作用机制:①分离正常小鼠BMDM,体外加入1ng/ml Pam3CSK4孵育6h使其活化,用ELISA的方法检测上清中IL-6和TNF-α的水平,用real time-PCR的方法检测细胞中IL-6和TNF-α在mRNA水平的表达。将体外激活的BMDM注射到OA小鼠模型中,4周后膝关节组织切片用番红-O染色观察软骨组织的破坏程度,并通过OARSI评分对其软骨损伤程度进行评价。②分离OA小鼠滑液中巨噬细胞,流式细胞仪检测其PD-L1水平,巨噬细胞体外用PD-L1抗体处理,注射至OA小鼠模型关节腔内,同时给小鼠腹腔注射IL-6和TNF-α抗体。4周后处死小鼠,膝关节组织切片用番红-O染色观察软骨组织的破坏程度,并通过组织学和OARSI评分对其软骨损伤程度进行评价。结果1.阻断PD-L1免疫检查点在小鼠OA模型中的作用:结果显示PD-L1抗体阻断后,膝关节制备矢状位石蜡切片,番红-O染色显示出更严重的关节软骨损伤,较高的OARSI评分也表明PD-L1阻断后小鼠膝关节的软骨状况较差(p<0.05)。采用ELISA的方法检测了血清和关节滑液中炎性细胞因子IL-6和TNF-α的水平,结果显示在用胶原酶处理的小鼠中PD-L1阻断后血清和滑液中IL-6和TNF-α水平明显增加(p<0.05)。通过real time-PCR检测滑膜组织中IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β的mRNA水平,结果显示胶原酶诱导的OA中的PD-L1阻断后IL-6(p<0.01)、TNF-α(p<0.05)的表达显著增强,但不影响IL-10和TGF-β的mRNA水平。2.体外阻断PD-1/PD-L1通路介导的免疫反应在OA中的作用:分离OA小鼠模型关节腔滑液中免疫细胞,体外用PD-L1抗体处理,用ELISA的方法检测培养上清中IL-6和TNF-α的水平,结果显示PD-L1抗体处理后,免疫细胞上清中IL-6和TNF-α的水平明显增加(p<0.05)。用流式细胞仪对免疫细胞进行表型分析发现,巨噬细胞占81.6%,T细胞占9.2%,流式细胞仪对滑液中巨噬细胞和T细胞进行分选,分选后流式细胞仪检测表型,纯度均在90%以上,对巨噬细胞和T细胞分别用PD-L1抗体进行处理,Western blot的方法分别检测巨噬细胞和T细胞IL-6和TNF-α蛋白水平的表达,结果显示PD-L1抗体处理后,IL-6和TNF-α的蛋白水平仅在巨噬细胞中升高但在T细胞中不升高。3.探讨PD-1/PD-L1通路在小鼠OA中的作用机制:分离正常小鼠BMDM,体外加入Pam3CSK4使其活化,分别用real time-PCR和ELISA的方法检测IL-6和TNF-α在mRNA和细胞培养上清中的表达水平,结果显示BMDM活化后IL-6和TNF-α在mRNA水平(p<0.05,p<0.001)和上清中(p<0.01)均明显增加。将活化的BMDM注射到胶原酶诱导的OA小鼠模型中,4周后膝关节组织切片,用番红-O染色观察软骨组织的破坏程度,并通过OARSI评分对其软骨损伤程度进行评价,发现注射Pam3CSK4处理的BMDM骨关节炎程度明显加重(p<0.05)。分离OA小鼠滑液中巨噬细胞,流式细胞仪检测PD-L1水平,发现PD-L1表达较对照组明显增加。将巨噬细胞体外用PD-L1抗体处理,注射至OA小鼠模型关节腔内,同时给小鼠注射IL-6和TNF-α抗体,番红-O染色和OARSI评分显示注射抗PD-L1处理的巨噬细胞产生更严重的关节软骨损伤(p<0.01),而阻断IL-6和TNF-α可降低由抗PD-L1处理的巨噬细胞加剧的关节软骨损伤(p<0.05)。结论1.阻断PD-1/PD-L1通路可加重小鼠OA的软骨损害,促进OA病情进展。2.阻断PD-L1可上调OA小鼠体内的炎症反应,引起IL-6和TNF-α水平升高。3.PD-1/PD-L1通路对OA关节内的巨噬细胞具有负性调节作用,体外阻断PD-L1可促进巨噬细胞活化,产生高水平IL-6和TNF-α。4.OA小鼠关节滑液中浸润的免疫细胞主要为巨噬细胞,表面高表达PD-L1。5.活化的正常骨髓巨噬细胞产生高水平IL-6和TNF-α,可加剧OA的发展。6.PD-1/PD-L1通路参与OA发生发展的机制是:阻断PD-1/PD-L1通路后会导致关节内的巨噬细胞活化,进而激活固有免疫系统,促进IL-6和TNF-α分泌增加,上调炎症反应,加剧OA的发生发展。7.IL-6和TNF-α抗体可降低由抗PD-L1处理的巨噬细胞加剧的关节软骨损伤。创新性和研究的意义1.本课题创新性的提出了阻断PD-1/PD-L1通路导致OA病情进展的观点,并通过实验证明阻断PD-L1会上调炎症反应,促进炎症因子表达水平增加,加重软骨损伤,加速小鼠OA的进展。2.本课题首次通过实验证明了 PD-1/PD-L1通路对OA关节内的巨噬细胞具有负性调节作用,体外阻断PD-L1可促进巨噬细胞活化,激活固有免疫应答,上调炎症反应,加剧OA病情发展。3.本课题首次通过分子机制研究发现小鼠OA中巨噬细胞高表达PD-L1,并阐明了阻断PD-1/PD-L1通路加剧OA发展的机制是通过活化关节内的巨噬细胞,激活固有免疫应答,上调炎性细胞因子IL-6和TNF-α的表达,进而加剧软骨退变损害。4.本课题研究为探讨OA的发病机制指出了新的研究方向,为OA患者的临床治疗提供了潜在的诊断标准和治疗靶点。通过OA患者巨噬细胞PD-L1的表达检测,及时反映关节软骨早期退变等有关病理变化,这将对骨性关节炎的早期诊断、治疗及预后评价起到积极的指导作用。局限性机制探讨不够详尽,下一步将继续探讨PD-1/PD-L1通路调节巨噬细胞产生炎性细胞因子的具体信号通路,寻找PD-1/PD-L1通路的下游靶点。