双光子扫描显微成像技术将激光扫描与双光子激发相结合，使用近红外光作为激发光，具有成像深度深、光漂白光毒性小的特点，该技术适合用于对细胞、胚胎及组织等样品进行成像，在生命科学领域得到了广泛的应用。然而双光子显微镜的分辨率限制阻碍了该技术的进一步应用。将受激辐射损耗技术引入到双光子显微镜中，可以突破光学衍射极限，提高成像分辨率，实现对深层生物组织的高分辨三维层析成像。本论文中设计并搭建了基于双检流计振镜的双光子扫描显微镜，应用该系统研究了上转换纳米荧光微粒的发光特性，为了提升系统的分辨率，设计并搭建了双光子受激辐射损耗显微镜。　　本论文第一章从原理方面对双光子显微镜、受激辐射损耗显微镜和双光子受激辐射损耗显微镜进行了论述，介绍了一种新的可替代有机荧光染料的上转换纳米荧光微粒，对其发光性质进行了讨论。　　第二章介绍了自主搭建的双光子扫描显微成像系统。对主要组成部分:激光扩束模块、振镜扫描模块以及荧光信号采集模块进行了介绍，并对双光子显微镜的成像视场和分辨率进行了标定，使用该系统对生物细胞样品实现了高信噪比的双光子激发成像和三维层析成像。　　第三章介绍了在搭建的双光子扫描显微成像系统上开展的对上转换纳米荧光微粒发光性质的研究。研究发现，单分散状态和聚集状态的上转换纳米荧光微粒的发光性质有着明显的差异，前者为单光子激发，而后者为多光子激发;利用自主设计的荧光寿命测量系统对上转换纳米荧光微粒进行测量，得到前者的荧光寿命约为后者的一半。通过建立上转换发光的能级跃迁模型和数值模拟，很好地解释了上述现象发生的原因:聚集状态的上转换纳米荧光微粒由于粒子间距小，可以通过相互之间的共振能量转移传递能量，导致其发光性质的明显差异。　　第四章介绍了拓展的双光子受激辐射损耗显微成像系统。对受激辐射损耗的光调制光路的主要组成部分:光源模块、光学延迟模块，脉冲展宽模块以及螺旋相位板进行了介绍，并对受激辐射损耗光的时间延迟量、激光脉冲宽度程度以及环型中空光斑的质量进行了计算和测量。在激发光与损耗光三维空间重合的基础上，成功实现了受激辐射损耗效应。　　论文最后对本课题的研究工作进行了总结，并指出了下一步工作的研究方向。