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目的:
肌球蛋白轻链激酶(myosinlightchainkianse，MLCK)是平滑肌收缩过程中的关键酶。当平滑肌细胞受到刺激后，细胞内的Ca2+浓度升高，MLCK可以通过与Ca2+/CaM复合物相结合，磷酸化肌球蛋白20KD的调节轻链(regulatorylightchain，RLC)，从而激活肌球蛋白ATP酶的活性，调节肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，促进平滑肌的收缩，这是MLCK调节平滑肌收缩的经典激酶调节机制。MLCK除了具有激酶活性之外，还具有与肌球蛋白和肌动蛋白相结合的非激酶活性。此外，MLCK对细胞的迁移以及细胞骨架的重组也发挥着重要的作用。为了研究MLCK的非激酶活性对血管平滑肌细胞骨架的影响，本实验利用PCR和分子克隆技术构建了牛胃重组全长MLCK真核表达载体，并且以此为基础，对牛胃重组全长MLCK的1002-1022氨基酸（即CaM结合位点）进行定点突变，获得CaM结合位点突变原核和真核表达载体，为深入研究MLCK的非激酶活性对平滑肌细胞收缩迁移的影响奠定了实验基础。
方法:
(1)以构建的MLCK全长原核表达载体pCold-MLCK为模板，设计PCR引物，上游引物中加入NheⅠ酶切位点和Flag标签序列(DYKDDDDK)，Flag标签位于MLCK的N端，该标签抗体可用于检测转染的成功与否以及转染效率。以pCold-MLCK质粒为模板进行PCR扩增，获得533bp目的片段。用NheⅠ/KpnⅠ分别双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，获得144bp目的片段和5.4kb的载体片段，将二者相连接得到pcDNA-F-MLCK144质粒。再用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-MLCK质粒和pcDNA-F-MLCK144质粒，分别获得3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得重组的pcDNA-F-MLCK质粒。(2)根据CaM的结合位点，设计PCR引物，在上游和下游引物中分别加入NheⅠ和EcoRⅠ酶切位点，以pcDNA-F-MLCK质粒为模板进行PCR。用NheⅠ和EcoRⅠ分别双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，获得700bp的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得亚克隆质粒pcDNA-MLCK700。针对CaM结合位点设计突变引物，使MLCKcDNA序列中的T3016、G3017突变为G3016、C3017。以亚克隆质粒为模板进行PCR突变，获得CaM结合位点的亚克隆突变体pcDNA-MLCK700-CaM。用NcoⅠ分别酶切pcDNA-MLCK700-CaM质粒和pCold-MLCK质粒，获得556bp目的片段和7.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的原核表达突变体pCold-M-CaM质粒。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-M-CaM质粒和pcDNA-F-MLCK质粒，分别得到3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM。
结果:
(1)以质粒pCold-MLCK为模板，经PCR扩增后得到一条533bp目的片段，该片段大小与预期一致。用NheⅠ和KpnⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，分别得到144bp的目的片段和5.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得pcDNA-F-MLCK144质粒，该质粒经测序结果与预期一致。再用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-MLCK质粒和pcDNA-F-MLCK144质粒，分别获得3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得重组的pcDNA-F-MLCK质粒，该质粒经测序结果与预期一致。(2)以质粒pCold-MLCK为模板，经PCR扩增后得到一条700bp目的片段，该片段包含CaM结合位点。用NheⅠ和EcoRⅠ双酶切PCR产物和pcDNA3.1质粒，分别得到700bp的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得亚克隆质粒pcDNA-MLCK700，该质粒经测序结果与预期一致。针对CaM结合位点设计突变引物，以亚克隆质粒为模板进行PCR突变，获得CaM结合位点的亚克隆突变体pcDNA-MLCK700-CaM，该质粒经测序结果与预期一致。用NcoⅠ单酶切pcDNA-MLCK700-CaM质粒和pCold-MLCK质粒，分别获得556bp目的片段和7.4kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的原核表达突变体pCold-M-CaM质粒，该质粒经测序结果与预期一致。(3)用KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切pCold-M-CaM质粒和pcDNA-F-MLCK质粒，分别得到3.4kb的目的片段和5.5kb的载体片段，用连接酶将二者相连接获得CaM结合位点的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM，该质粒经测序结果与预期一致。
结论:
(1)通过DNA序列测定及分析结果显示，本实验已经成功地构建了MLCK重组野生型真核表达载体pcDNA-F-MLCK。(2)通过定点突变的方法获得CaM结合位点突变的原核表达载体pCold-M-CaM，该质粒可用于原核表达，进行功能研究。(3)利用PCR及分子克隆技术获得CaM结合位点突变的真核表达载体pcDNA-F-M-CaM，该质粒可转染至MLCK基因沉默的平滑肌细胞中，进行表达及功能研究。本实验为进一步研究平滑肌细胞收缩及迁移分子机制提供了一定的实验基础。