保罗样激酶(Polo-Like Kinases，PLKs)是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，至今在哺乳动物中发现PLK1-5五种亚型。PLK1是其中研究最为深入的家族成员，在细胞有丝分裂期中的多个阶段如有丝分裂期进入、中心体成熟、细胞质分离等发挥重要的作用，其活性受到严格的调控。PLK1在大多数人类肿瘤细胞中呈过表达状态，而且PLK1的过表达往往伴随着预后不良，因此被认为是重要的抗癌药物靶标。PLK1由N端高度保守的激酶结构域(Kinase Domain，KD)以及C端的PBD结构域(Polo-box Domain，PBD)组成，其中PBD是PLKs激酶家族所特有，通过识别磷酸化底物来调控PLK1激酶的亚细胞定位以及在细胞周期中的活性。阻断PBD结构域与磷酸化底物结合能够显著地干扰PLK1激酶的亚细胞定位以及活性，越来越多的研究显示PBD结构域是设计靶向PLK1激酶选择性抑制剂的理想靶点。本论文综合了生物化学、细胞生物学、结构生物学以及计算化学等多种手段，针对PLK1激酶PBD结构域对底物的识别模式、不同PLKs的PBD对底物的选择性、以及基于PBD的三维结构设计及筛选特异性抑制剂进行了深入的研究。　　论文第一部分主要研究底物磷酸化对底物结合PBD结构域的影响。利用荧光偏振(FP)、等温滴定量热技术(ITC)、以及色氨酸天然荧光等方法系统研究了PLK1激酶的PBD结构域对磷酸化及非磷酸化小肽底物的识别。实验结果显示磷酸化对底物结合PBD结构域非常重要，除了个别底物，如非磷酸化的Map205蛋白能以非经典的模式结合PBD外，大多含有PBD结合系列-Ser-(Thr/Ser)-(Pro/(X))的小肽底物在非磷酸化状态基本不结合PBD。进一步研究发现之前一些文献报道所观察到非磷酸化小肽底物能够结合PBD可能是因为实验方法的局限以及数据解析的错误而造成的假象。该结果对重新定位磷酸化在调控PLK1的亚细胞定位中的功能有重要的启示意义。　　论文第二部分主要研究PLKs家族成员PBD结构域对底物识别的选择性。通过结构生物学与计算化学的手段，针对PLKs家族成员PLK1与PLK2的PBD结构域对底物识别的选择性展开深入研究，揭示了决定PBD结构域识别底物选择性的关键区域。此外，本课题组首次解析PLK2的PBD结构域的晶体结构，为理解PLK2的PBD结构域与底物结合以及不同PLKs家族成员PBD结构域对底物的选择性提供结构的基础。　　论文第三部分主要研究了靶向PBD结构域的特异性小肽抑制剂。在靶向PBD的小肽抑制剂设计过程中磷酸基团较差的细胞膜通透性是必须重点考虑的因素，利用系统策略设计变色龙样的小肽抑制剂，在小肽设计过程中引入分子内氢键以及分子内离子对、分子间螺旋偶极-电荷相互作用等元素，使得小肽能同时适应不同的环境，如具备良好的水溶性、细胞膜通透性、靶标蛋白PBD的亲和性等。实验结果验证了本课题组的设计理念，新设计的小肽与PBD结构域的结合能力比文献报道的最优多肽提高十倍以上，而且水溶性及细胞膜通透性也有显著的提高。此外，本课题组成功解析了新设计小肽与PBD结构域复合物的晶体结构，在结构基础上进一步验证了分子内氢键以及螺旋偶极-电荷相互作用的设计对提高小肽抑制剂与PBD结构域相互作用有重要的作用。该结果为设计靶向PLK1激酶PBD结构域特异性小肽抑制剂提供了新的思路。　　论文第四部分主要研究靶向PBD结构域的小分子抑制剂。通过计算机对近500万个小分子进行了虚拟筛选并选择其中五十个化合物进行实验测试，最后成功获得了两类对PBD结构域有较好的抑制活性的小分子抑制剂，分别是儿茶酚类小分子和喹唑啉类多环类化合物。它们在蛋白水平对PBD结合最优小肽的抑制效果分别在微摩尔和纳摩尔级别，并且对PLK1有较显著的选择性。进一步的细胞实验显示这两类小分子可以通过影响PLK1的亚细胞定位，将细胞周期成功阻滞在有丝分裂期并且引起细胞凋亡。该结果为进一步研究靶向PLK1激酶PBD结构域的小分子抑制剂奠定良好的基础。　　总而言之，本论文的系统研究为理解PLK1激酶PBD结构域对底物的识别模式、不同PLKs的PBD对底物的选择性、以及发现靶向PBD结构域的特异性抑制剂奠定良好的基础。