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本论文主要涉及两方面的工作,一是用核磁共振和生化实验研究了人源mitoNEET的结构和体外功能;二是用异核核磁共振技术研究了硫磺矿硫化叶菌古菌蛋白SSO0941的溶液三维结构。
1.人源mitoNEET蛋白质基于结构的功能研究。
人线粒体外膜蛋白mitoNEET可以特异地结合抗糖尿病药物吡格列酮(pioglitazone),可能是吡格列酮发挥药物功能的一个靶蛋白。mitoNEET是一个同源二聚体,每一个单体结合一个[2Fe-2S]簇。在酸性条件下,[2Fe-2S]簇不稳定,结合比格列酮可以稳定[2Fe-2S]簇。我们发现mitoNEET可以结合NADP(H),并会导致[2Fe-2S]簇更加不稳定。NMR滴定实验和ITC实验证明NADP(H)与mitoNEET弱结合,NADP(H)腺苷基团和mitoNEET的K55与H58是相互作用的主要残基基团。紫外-可见吸收光谱实验得出,NADPH的结合促使[2Fe-2S]簇从mitoNEET加速解离。CD和NMR实验证实,[2Fe-2S]簇的解离将破坏mitoNEET的三维结构。对mitoNEET三维结构的分析指出,mitoNEET一个亚基的K55和H58分别与另一亚基的H87’和R73’相近。而残基H87是[2Fe-2S]簇配位基团,R73位于[2Fe-2S]簇Fe-1配位基团C72与C74之间。NADP(H)通过结合K55与H58,影响Fe-1的配位和H87的质子化,从而降低的[2Fe-2S]簇的稳定性。上述结果为进一步研究mitoNEET在体内的功能及其与糖尿病的关系提供了有意义的实验数据。
2.硫磺矿硫化叶菌古菌蛋白SSO0941的溶液三维结构研究
SSO0941来源于硫磺矿硫化叶菌Sufolobus solfataricus P2,在泉古菌中保守,是功能结构未知的假想蛋白。我们应用异核核磁共振方法解析了SSO0941的溶液三维结构。SSO0941的二级结构包含7个α-螺旋和由8个β-折叠股构成的三个β-片层,二级结构之间按α1-β2-α2-β2-β3-α3-α4-β4-β5-β6-α5-β7-α6-β8-α7的次序排列,形成一个α/β类型蛋白,是一种新的折叠。基于结构的比对,我们发现SSO0941的C-端由β5-β6-α5-β7-α6-β8组成的结构域分别与ATP-依赖的DNA解旋酶UsvW,DNA错配修饰蛋白MutS,TRNA-剪辑核酸内切酶的一个结构域明显相似,而这些结构域都与DNA结合有关,因此我们推测SSO0941可能结合DNA。