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骨肉瘤是属于骨组织原发性肿瘤,并且在生活当中经常发生,在年轻人当中出现的频率相对更高[1-2],恶性程度相对较高,现如今临床诊治骨肉瘤的手段是手术诊治并辅助化疗。肿瘤的形成和发展是一个多因素、多阶段、渐进的过程。早期诊断和及时的干预对患者的预后是至关重要的。随着肿瘤学研究的不断深入,基因靶向治疗也逐渐转变成现实,骨肉瘤治疗的可能性大幅上涨。基因靶向治疗是借助分子生物学的方式对骨肉瘤在发展过程进行干预,促使其出现异常表述的癌相关基因,对肿瘤的恶性生物学特点有一定的压制意义以此来诊治骨肉瘤。所以,对新的骨肉瘤治疗的分子靶点进行调研,在某种意义上为基因靶向治疗奠定了理论意义的基础。最新的研究发现,核受体共调节激活因子5(NCOA5)是核受体共调节因子具有广泛表达的579个氨基酸。它也是雌激素受体和核受体辅激活因子,NCOA5是一种在人类细胞中通过雌激素受体转录介导雌激素,NCOA5也可以实现调控基因缺陷可导致癌症和糖尿病。姜黄素属于天然植物多酚类色素,其提取主要是从姜科植物姜黄当中,在其他姜科类植物当中也有涉及。普遍出现在中药姜黄的根茎当中。经过调研探索我们知道,姜黄素可以抑制肿瘤细胞侵袭转移,在骨肉瘤中,姜黄素是不是可以借助NCOA5靶点抑制肿瘤的侵袭转移,到现在也没有清晰的调研。这一实验调研了不同浓度的姜黄素对人体骨肉细胞MG-63细胞NCOA5表达的作用,更深层次的研究了作用于骨肉瘤侵袭转移的体制,从理论上临床诊治骨肉瘤运用姜黄素奠定了基础。本研究拟探索和研究NCOA5在骨肉瘤发生发展中作用以及姜黄素抑制骨肉瘤MG-63活性的作用机制,为进一步探索骨肉瘤新的分子治疗靶点具有重要的科学意义。第一部分NCOA5表达与骨肉瘤发生及预后的关系研究本部分为了研究核受体共调节激活因子5(NCOA5)蛋白表达与骨肉瘤患者的关系,收集了盐城市第一人民医院、盐城市中医院和盐城市第三人民医院145例患者和100例正常骨组织标本作为对照组,采用免疫组织化学技术(IHC)和RT-PCR法检测人骨肉瘤组织中NCOA5蛋白。免疫组织化学染色显示,骨肉瘤的NCOA5蛋白的阳性率为26.21%(38/145),正常骨组织中阳性率为82%(82/100),显著高于人骨肉瘤组织中。RT-PCR结果显示,NCOA5 m RNA在人骨肉瘤组织中的阳性表达率为17.24%(25/145),正常骨组织中阳性率为84%(84/100),显著高于人骨肉瘤组织中。骨肉瘤患者生存率不仅是对NCOA5蛋白的表达相关(HR=0.33,P=0.031),但也与肿瘤的位置(HR=0.34,P=0.037)和分化(HR=4.12,P=0)分期(HR=6.36,P=0.017)相关。我们得出结论:NCOA5 m RNA和蛋白的表达在人骨肉瘤组织中是一致的。NCOA5在人骨肉瘤组织中低表达,而在正常骨组织中高表达。NCOA5的低表达与人类骨肉瘤发生密切相关,也与人类骨肉瘤患者生存率相关。第二部分姜黄素对NCOA5基因的调控和对MG-63细胞的抑制及作用机制本部分为了研究姜黄素对骨肉瘤细胞MG-63的生长抑制作用,以及对骨肉瘤细胞中NCOA5基因表达的调控作用,从而能初步明确姜黄素对骨肉瘤细胞的作用机制。以人骨肉瘤细胞株MG-63为研究对象,采用不同剂量姜黄素进行处理。运用MTT法检测5,10,15,20,25,30,35,40,50umol/L姜黄素作用24,48,72h对细胞的毒性作用,发现姜黄素浓度﹥15 umol/L,作用时间﹥24h时,对细胞的生长抑制呈时间和剂量依懒性(P﹤0.001),当姜黄素浓度≦15 umol/L,作用时间为24h时,对细胞无明显毒性作用,细胞存活率﹥85%;Transwell小室侵袭实验法检测5,10,15umol/L姜黄素对细胞的侵袭能力,粘附实验法检测其对细胞的粘附能力,发现细胞侵袭能力和粘附能力随着姜黄素浓度的增加而逐渐降低,以15 umol/L姜黄素浓度处理效果最明显(P﹤0.05);Western blot法检测5,10,15umol/L姜黄素作用后NCOA5蛋白表达水平的影响,RT-PCR法检测对细胞中NCOA5基因m RNA转录水平的影响,发现姜黄素可明显促进NCOA5蛋白表达水平和NCOA5基因m RNA转录水平,其促进作用与剂量呈高度依懒性(P﹤0.05)。我们得出结论:姜黄素可通过促进靶基因NCOA5表达降低人骨肉瘤细胞株MG-63的侵袭性。综上所述,NCOA5表达在骨肉瘤发生发展中发挥着重要的作用,姜黄素可以促进NCOA5表达从而抑制MG-63细胞侵袭性,从而抑制骨肉瘤的发生发展,NCOA5可以作为治疗骨肉瘤潜在的分子靶点。