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人类基因组计划的迅速发展促进了核酸分析技术在突变检测、分子诊断和疾病预防以及治疗评估中的应用,寻找快速、易定量、自动化和高通量的核酸检测分析方法至关重要。毛细管电泳(Capillary electrophoresis,CE)具有分离效率高、操作模式多、试样消耗少等优点,已成为蛋白质和核酸等生物大分子分离分析中不可或缺的工具。毛细管凝胶电泳(Capillary gel electrophoresis,CGE)和毛细管无胶筛分电泳(Non-gel capillary electrophoresis,NGCE)是两种常用的操作模式。CGE可有效分离分子量范围为50~2000 bp的较小DNA片段,具有较高分辨率。但是其凝胶黏度较大,制备和运行过程中容易产生气泡,使体系的稳定性和重现性变差,对于较宽分子量范围的DNA片段分辨率较低。NGCE以低粘度的线性高分子溶液为筛分介质,溶液中高分子之间相互交缠形成网孔,可起到筛分作用。这些低粘度的高分子溶液可提供更快速,更稳定的分离,允许更大的灵活性和压力注射,也更容易实现自动化。NGCE可以提供更大孔隙的筛分介质,有利于分离较宽分子量范围的DNA片段,提高DNA测序对大分子片断的认读长度。本论文分别用CGE和NGCE分离分析宽分子量范围DNA片段,并建立方法学,发现方法存在的问题,用新方法制作涂层毛细管柱解决分离过程中重现性差,柱寿命短等问题。本论文主要内容如下:第一章:综述了核酸分离分析的意义和常用的技术手段,介绍了CGE和NGCE的基本概念及其在核酸分离分析中的应用。第二章:以文献方法制作的线性聚丙烯酰胺(Linear polyacrylamide,LPA)涂层毛细管柱为分离通道,LPA为凝胶,采用CGE分离模式,优化分离条件建立了100~2000bp分子量范围DNA片段的分离方法。在优化的CGE分离条件下,选择QDL 2,000 DNA Marker(包含100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp六个DNA片段)为测试样品,建立了DNA片段分子量和迁移时间的函数关系;对该CGE分离方法进行了方法学验证,并用于PCR扩增产物中DNA片段的定性和定量分析。结果表明,该方法虽然制备凝胶柱时不易产生气泡,但是CGE凝胶柱使用寿命较短,需要多次更换凝胶。这可能是由于CGE的凝胶不稳定造成的。第三章:以文献方法制作的LPA涂层毛细管柱为分离通道,LPA为筛分介质,采用NGCE分离模式,建立了250~10000 bp分子量范围DNA片段的分离方法。在优化的分离条件下,选择DL 10,000 DNA Marker(包含250 bp、500 bp、1000 bp、2000 bp、4000 bp、7000 bp和10000 bp七个DNA片段)为测试样品,对建立的NGCE分离方法进行了方法学验证。结果表明,该方法对2000 bp以下分子量范围的DNA片段,结果准确可靠,重现性好;对2000 bp以上分子量范围的DNA片段,结果重现性较差,这可能是由于毛细管涂层柱的稳定性不好,容易脱落,造成较大分子量DNA片段(2000bp以上)在分离柱内壁上的吸附。第四章:以丙烯酰胺(Acrylamide,AA)为反应单体,过硫酸铵(Ammonium persulfate,APS)为引发剂,四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine,TEMED)为加速剂,配制预聚合溶液,充入预处理过的毛细管中原位聚合制备LPA涂层毛细管柱。选择DL 10,000 DNA Marker为测试样品,在第三章优化的NGCE分离条件下,考察了不同浓度AA制备的LPA涂层毛细管柱对250~10000 bp分子量范围DNA片段的分离性能,考察涂层柱的柱内和柱间稳定性。结果表明,当AA单体浓度为5%时,LPA涂层毛细管柱具有良好的稳定性和较长的使用寿命,可以用于较宽分子量范围DNA片段的分离分析。第五章:结论与展望。