【摘 要】
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目的:建立双波长HPLC法,比较研究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤中有效成分含量变化;并基于ERK、p38 MAPK通路,探究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤干预绝经后骨质疏松症模型大鼠去卵巢术后30d,60d,90d的作用及其机制。方法:1、采用双波长HPLC法测定山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤（以下分别简称六（山）,六（酒））中七种有效成分:莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-羟甲基
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目的:建立双波长HPLC法,比较研究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤中有效成分含量变化;并基于ERK、p38 MAPK通路,探究山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤干预绝经后骨质疏松症模型大鼠去卵巢术后30d,60d,90d的作用及其机制。方法:1、采用双波长HPLC法测定山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤（以下分别简称六（山）,六（酒））中七种有效成分:莫诺苷、马钱苷、獐牙菜苷、芍药苷、没食子酸、5-羟甲基糠醛以及丹皮酚的含量。色谱条件:Hypersil C18色谱（4.6mm×250mm,5μm）,流动相乙腈--0.3%磷酸,梯度洗脱（0-7 min,0-8%乙腈;7-15min,8-10%;15-20min,10-15%;20-30min,15-23%;30-50min,23-45%）,流速0.6 m L/min,检测波长:240nm（莫诺苷,马钱苷,獐芽菜苷,芍药苷）,274nm（没食子酸,5-羟甲基糠醛,丹皮酚）,柱温30℃,进样量20μl。2、6-8月龄SD大鼠,分假手术组,模型组,阳性药物组、山萸肉配伍入六味地黄汤组（六（山）组）和酒萸肉配伍入六味地黄汤组（六（酒）组）,去卵巢术后第5d开始给药,每周称重,并于术后30d,60d,90d分批取各组大鼠4-5只,称重后麻醉,取血清,双侧股骨,并取脏器（子宫,脾,肝,双肾以及心脏）称重。分别采用全自动生化仪以及化学发光微粒子免疫检测法检测大鼠血清钙（Ca）、磷（P）水平和雌二醇（E2）水平;双能X线骨密度仪测定大鼠骨密度（BMD）值;HE染色法观察大鼠骨组织形态学变化;Western Blot（WB）法测定大鼠骨组织中ERK1/2、p28蛋白表达。结果:1、山萸肉酒制前后配伍入六味地黄汤中均含有莫诺苷,马钱苷,獐牙菜苷,芍药苷,没食子酸,5-羟甲基糠醛以及丹皮酚七种有效成分,且六（酒）中七种有效成分总含量高于六（山）（p＜0.01）。其中,六（酒）中没食子酸、5-羟甲基糠醛高于六（山）（p＜0.01）,而莫诺苷含量则较六（山）低（p＜0.01）;2、与假手术组比较:术后30d,60d,90d,模型组大鼠血清Ca,P,E2水平及子宫指数、ERK1/2,p38蛋白相对表达量均降低（p＜0.01）,骨组织结构损害程度逐渐加深,表现为骨髓腔、脂肪细胞逐渐增多,骨小梁排列渐稀释,骨小梁数量变少甚至后期出现断裂;术后60d,90d,模型组大鼠BMD值降低（p＜0.01）。3、与模型组比较,术后30d,60d,90d,六（山）组及六（酒）组大鼠血清E2、Ca、P水平及子宫指数均升高（p＜0.05）,六（山）组、六（酒）组骨组织结构有明显改善,但随着术后时间延长,六（山）组、六（酒）组改善骨组织微结构作用减弱;术后60d,90d,ERK1/2,p38蛋白相对表达量均升高（p＜0.05）;术后90d,六（山）组及六（酒）组BMD值明显升高（p＜0.05）,六（酒）组肝脏、脾脏指数升高（p＜0.05）。4、与六（山）组比较,术后60d,90d,六（酒）组E2水平和p38蛋白相对表达较高（p＜0.05）;术后90d,六（酒）组的ERK1/2蛋白相对表达以及BMD值较高（p＜0.05）。结论:1、山萸肉酒制后配伍入六味地黄汤中没食子酸,5-HMF含量增加,而莫诺苷含量降低;2、在去卵巢术后60d至90d,6-8月龄SD大鼠血清钙、磷、雌激素水平及骨密度值明显低于正常大鼠,骨组织微结构恶化明显,可用作研究PMOP病理机制和防治的动物模型;3、山萸肉炮制前后配伍入方的六味地黄汤均能在绝经早期即有效干预PMOP,从而可延缓其发生发展,且六（酒）作用优于六（山）。其机理可能与该方能改善血清雌激素、钙、磷水平,激活ERK、p38 MAPK通路,进而调节骨代谢失衡,改善骨密度有关。
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