慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性增殖性疾病，我国年发病率0.36/10万，占各类白血病的20％，占慢性白血病的95％，如不经有效治疗，诊断后平均生存期约2年。目前临床上常用的治疗方法（化疗、放疗和造血干细胞移植）都存在一定的局限性，因此需要探索一种新的有效治疗白血病的方法。军事医学科学院二所三室构建的携带人野生型p53基因和肿瘤免疫相关基因GM-CSF、B7-1的重组腺病毒（命名为BB-102），感染喉癌、肝癌、肺癌原代细胞后，能明显抑制癌细胞的增殖并诱导其凋亡，而且体外能诱导自体外周血淋巴细胞生成肿瘤杀伤性的CTL。本实验应用该重组腺病毒在体外修饰CML原代细胞作为瘤苗进行CML生物治疗的实验研究，以期为CML的临床治疗提供新的方案。据此，本研究完成以下具体工作：1．重组腺病毒的扩增与质量检定 在293细胞中分别扩增Ad-p53、BB-102以及携带绿色荧光蛋白基因的对扫要照重组腺病毒AdGFP；以氯化艳密度梯度超速离心法纯化病毒；以蚀斑分析法测定病毒滴度；按照《中国生物制品规程）之通则，检测重组腺病毒BB－102的质量。结果表明：Ad一GFP、Ad一P53和 BS一102的滴度分另为 1．IX 10’‘、1．4xm”、2．qxmp；重组腺病毒朋《0二的质量符合《中国生物制品规程》的要求；重组腺病毒介导的目的基因可在靶细胞中有效表达。2．重组腺病毒载体（AdV）对白血病细胞系和原代白血病细胞转染率的研究 分别以不同MOI的＊－GFP感染K562细胞和原代髓系白血病细胞，48 ，J’时后检测转染率，确定适宜的M01；以sng、mmg、15mg／二的Mp。fectMLne分别包裹相同MOI的AdAIFP后感染原代白血病细胞，检测转染率，选择适宜的脂质体一久w配比：以丝裂原Pm、C。n A和细胞因子几－2、GeC取、m3MCAb分别预处理髓系白血病原代细胞，而后转染Ad－GFP，检测转染率；分别以①IL－2、IL－3、G－CSP（23O②IL－2、IL－3、G－CSF、Pm（23GP）③IL－2、IL－3、GMdSF （23GM④IL－2、IL－3、GM－CSF、PHA （23GMP⑤IL－2、IL－6、G－CSF （26G③IL－2、IL－6、G－CSF、PHA（26GP）③几－2、IL－6、GMSF（26GM）③IL－2、IL－6、GM－CSF、PHA（26GMP）预培养髓系原代白血病细胞后转染A个GFP；另以LioPfectamine先包裹Ad－－GFP，后施转染未以各因子处理的同一细胞，转染忧h后检测转染率：观察不同因素复合处理后髓系原代白血病细胞的超微结构。结果显示：AdV对白血病细胞系和原代白血病细胞转染率AdV对白血病细胞系和原代白血病细胞的转染率差异很大、普遍很低，CML细胞系K562及｝原代细胞的转染率较高，分别为 91．8％＄ 18．9％。转染效率与 MOI在一定范围内呈正相关，适宜的MOI为 400 pm／cell。单独应用细胞因子GM（SF、脂质体包裹AdV后可明显提高转染效率0＜0．05），IL工和 CD3MCAb的促转染作用相对较弱，有丝分裂原PHA、Con A具有一定的促转染作用。不同因素复合预处理后可显著提高AdV对CML原代细胞的转染率，其中以几－2、IL－3、G－CSF复合预处理组作用最为显著（P＜0．of）。经此处理后CML原代细 二 摘要 胞表面突起明显增多，呈微绒毛样，对照组细胞则表面光滑，且有明显的凋 亡相。 3．重组腺病毒介导人野生型的3、GM－CSF和B7－1基因在CML细胞系K562 细胞和原代细胞中的表达 分别以Western印迹杂交法、ELISA法和免疫荧光法检测BB－102介导的 人野生型P53、GM－CSF和B7－l基因在K562细胞及＊L原代细胞中的表达。 结果表明：重组腺病毒 BB－102能够有效地将其所携带的目的基因导入 CML 细胞并使其在细胞中高效表达，表达高峰期为转染后2～4d，此后随时间的 推移而递减，持续10天以上。 4．重组腺病毒介导的人野生型P53基因对K562细胞的抑制增殖和诱导凋亡 作用 以 BB－102感染 K562细胞后，连续 5 d观察细胞生长状况，计数活细胞， 绘制生长曲线：分别于感染重组腺病毒后24h、48h、72h、96h、120h取细胞 悬液，加入荧光染料 HoeChst33342和碘化丙锭（PI）染色。荧光显微镜下观 察，计数正常细胞、凋亡细胞和死亡细胞，计算其百分比；提取DNA，检测 片段化DNA。实验结果显示：AdGFP感染的K562细胞的增殖速度和光镜下的 细胞形态与对照组细胞没有明显差别；而BB1 感染的K562细胞的增殖受’到明显抑制；肠62细胞转染88－102后随着时间的增加，凋亡细胞和死亡细 胞逐渐增多，5天后凋亡细胞的比率近60％，转染Ad－GFP和对照组凋亡细胞 则明显少于前者；感染BB－102后56h的K562细胞呈现明显的DNA梯形带图 谱，其他组细胞则未见此现象。说明抑瘤作?