背景与目的近年来随着呼吸系统疾病发生率的快速上升,研究表明单纯只用基因库的变化来解释疾病的发生无法完整地揭示疾病的发生作用机制,环境污染是影响人类健康的众多危害因素之一,有关环境污染因素对呼吸系统相关疾病的发生发展的影响受到越来越多的关注。目前,科学的观点认为基因-环境的交互作用是绝大多数人类疾病的共同发病机制,其与呼吸系统的发病机制密切相关。人类呼吸系统作为直接和外界空气接触的器官,而细颗粒物（Fine Particular Matter）PM_2.5又是空气中主要的污染物,它能引起城市空气质量急剧恶化和灰霾天气的形成,加上其本身空气动力学直径小等特点更易进入人呼吸道、肺组织呼吸系统深部诱发呼吸系统相关疾病。同时由于PM_2.5比表面积大,易携带大量有机污染物、有害重金属、酸性氧化物以及细菌、病毒等各种有毒有害物质成分进而进入人体细胞后对人体健康造成严重危害。已有研究表明,人群呼吸系统症状（咳嗽、咳痰、喘息）的发生率与灰霾污染水平有关,灰霾污染增加了居民患呼吸系统、心血管系统疾病的风险,也增加了居民死于心肺系统疾病的风险。PM_2.5对呼吸系统的炎症效应是其最主要的毒作用,国内外大部分学者认为PM_2.5引起的肺部炎症是引起其它一系列毒理效应的基础,包括炎症可能进一步诱导破坏交感神经和副交感神经的平衡状态,从而引发一系列神经系统疾病。随着对表观遗传研究的深入了解及RNA高通量检测技术的发展,长链非编码RNA（long non-coding RNA）作为基因组中调节基因研究的新领域受到研究者们的广泛关注。长链非编码RNA是一类不编码蛋白质且转录本长度大于200nt的RNA分子。越来越多关于LncRNA在免疫炎症方面的研究表明,LncRNA能通过多种作用途径比如与T淋巴细胞中的某些细胞因子结合、调节免疫炎症相关基因的表达及影响某些免疫细胞的发育分化等从而参与调控免疫炎症疾病的发生发展过程。那么LncRNA在PM_2.5所导致的呼吸系统炎症反应中也是否发挥调节作用呢?在本次研究中,我们推测LncRNA在环境暴露诱导炎症反应中有着重要意义。我们用现场实时采集提取好的PM_2.5颗粒物暴露细胞染毒使其产生炎症反应;采用高通量测序手段检测分析发现PM_2.5处理细胞后胞内许多LncRNA基因表达发生改变;接着利用qRT-PCR确认关键LncRNA同时运用RNA干扰技术建立功能研究体系,分析LncRNA在炎症效应中的功能,最终发现LncRNA LOC101927514异常高表达在PM_2.5致炎过程中具有功能意义;通过基因高通量测序筛选和RNA Pull dwon等方法确认LncRNA LOC101927514调控的靶基因,揭示LncRNA LOC101927514在灰霾PM_2.5致呼吸系统炎症效应中的调控机制,从非编码RNA调控的表观遗传学角度阐明炎症的分子机制。方法1.PM_2.5采样与处理在广州市区越秀、天河、萝岗选取三个具有代表性的点位作为PM_2.5的采样点,用大流量颗粒物采样器已经2.5μm孔径的玻璃纤维滤膜（美国）进行样品采集。采集时间为2015年冬季以及2016年冬季期间。采集后,通过超声洗脱和冷冻干燥后得到PM_2.5采集膜上的颗粒物。处理得到的样品分成两部分,一部分样本用于化学成分分析实验,一部分样本用于后续的细胞毒性实验研究。2.CCK8法检测PM_2.5对细胞存活率的影响考虑后续的实验是进行细胞炎症反应模型的建立,为保证一定的细胞存活率,我们首先采用CCK8法检测PM_2.5对细胞活力的影响。同时结合电镜下直接观察暴露于PM_2.5后细胞形态的改变情况。3.体外细胞炎症模型实验称取0.1g重量干燥好的PM_2.5颗粒物溶于1mlPBS液中配制成0.1g/ml母液储备液,使用PBS稀释至不同终浓度PM_2.5染毒液去暴露处理人支气管上皮细胞（获赠于广州医科大学公共卫生学院蒋义国教授）,采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎性因子IL6和IL8的分泌量;进一步采用qRT-PCR法验证IL6和IL8转录本水平的变化。4.高通量测序分析PM_2.5处理细胞后LncRNA表达谱的改变在前期研究基础上,选择50和100μg/ml终浓度PM_2.5暴露染毒细胞48h后,在广州锐博生物有限公司进行高通量测序分析LncRNA的检测工作。5.qRT-PCR检测基因相对表达对有差异表达的LncRNA使用GoTaq?qPCR Master Mix（Promega USA）试剂盒进行实时荧光定量PCR法检测其表达。6.体外细胞功能实验选择干扰效率大于50%的LncRNALOC101927514 SiRNA序列,运用Lipofectamine 2000作为转染试剂,按照试剂说明书瞬时转染16HBE细胞6h以敲低LncRNA LOC101927514表达水平,然后加入PM_2.5染毒液暴露细胞48h后ELISA法检测细胞上清液中炎性因子的分泌量。7.LOC101927514亚细胞定位选择GAPDH作为胞质的内参基因,U6为胞核中的内参基因,使用PARIS?Kit试剂盒对16HBE细胞进行胞质胞核分离实验,qRT-PCR法检测各基因在胞浆胞核中的相对表达量。8.RNA Pull down由苏州讯泓生物科技股份有限公司进行基因合成连到pcDNA3.1质粒上作为RNA探针模板制备RNA Pull down的探针,将探针进行变性,形成RNA二级结构后再制备探针-磁珠复合物,利用RNA pull down实验技术从正常人支气管上皮细胞16HBE中钓取与lncRNA LOC101927514结合的蛋白。9.Western Blot实验用蛋白裂解液裂解16HBE细胞冰上快速提取细胞蛋白,配制下层是10%的SDS-PAGE分离胶上层为5%的浓缩胶进行蛋白的电泳分离,电泳后在电转至PDVF膜上孵一抗和二抗,最后用ODYSSEY双色红外激光成像系统扫描PDVF膜,对数据保存与分析,用软件odyssey V3.0分析,用β-actin作为内参。10.统计学分析数据统计分析采用SPSS 16.0软件,采用t检验进行两组间差异统计学意义比较。各实验组数据均采用均数±标准差,以α=0.05作为检验水准。结果1.PM_2.5化学成分分析我们对本研究采集的大气PM_2.5进行成分分析,结果表明重金属元素中Si、K、Na元素含量明显高于其他元素,浓度分别为3.65±2.36μg/m³、1.73±0.9μg/m³和1.62±1.23μg/m³。大气颗粒物中的主要水溶性离子有SO₄^2-、NO₃^-、Cl^-、F^-、NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Ca₂⁺、Mg²⁺等,SO₄^2-、NO₃^-及NH₄⁺是本研究PM_2.5中主要的水溶性离子,分别占PM_2.5质量的18%、7%和7%。PM_2.5中16种主要的多环芳烃（PAHs）总浓度约为9.05±6.82 ng/m³,BaP的平均浓度约为0.97±0.82 ng/m³,浓度均值未超过我国的标准限值（1ng/m³）（GB3095-1996）和WHO的标准值（1ng/m³）。PM_2.5碳质组分分析发现:OC和EC平均浓度分别为8.76±4.81μg/m³和3.91±2.67μg/m³,PM_2.5中OC/EC的比值大于2.2,有机碳含量明显高于无机碳含量。2.PM_2.5对细胞形态及活性影响不同浓度PM_2.5处理细胞48小时后,随处理浓度的不断增加,细胞形态受到影响,和细胞轮廓清晰背景干净的对照组相比,细胞轮廓随PM2.5浓度的增大变得界限不清,细胞也随PM_2.5暴露浓度的增大发生死亡。CCK8检测细胞活性随PM_2.5处理浓度的增加而活性降低。（*P<0.05,**P<0.01）3.PM_2.5对细胞炎性因子分泌量的影响同一浓度100μg/mlPM_2.5处理细胞不同时间后,细胞中分泌的细胞因子白介素6随暴露时间的增长而分泌增加;细胞因子白介素8未呈明显的时间-效应关系,但与无PM_2.5处理对照组相比,PM_2.5处理组分泌增加且差异有统计学意义（*P<0.05,**P<0.01）。不同浓度PM_2.5处理16HBE细胞48h后,随着处理浓度的增加,引起细胞分泌白介素6和白介素8升高,且呈一定的剂量依赖性。（*P<0.05,**P<0.01）。4.PM_2.5引起LncRNA的改变及关键LncRNA分子的筛选和对照组相比,50μg/mL和100μg/mL浓度组分别有58和308个lncRNA上调,13和15个lncRNA发生下调。50ug/ml、100ug/mlPM_2.5暴露处理后lncRNA LOC101927514表达发生上调且与PM_2.5暴露存在一定的剂量-反应关系。5.对lncRNA LOC101927514目标靶分子SiRNA后检测对炎症的影响与对照组比较,LOC101927514 RNAi后再加入100μg/mlPM_2.5暴露48h处理组(SiRNA-2+PM_2.5)炎性因子IL-6和IL-8对应mRNA在细胞中的表达量均有显著下降。6.lncRNA LOC101927514分子和STAT3蛋白分子之间相互作用对RNA-pull-down实验产物Western Blot检测预测的结合蛋白STAT3及其磷酸化形式进行检测,结果发现LncRNA LOC101927514结合STAT3,并且与之磷酸化的STAT3也结合。敲低lncRNA的表达,检测STAT3蛋白的本底表达和磷酸化的表达水平发现,本底STAT3表达不变,而磷酸化的P-STAT3蛋白发生改变。结论1.PM_2.5可以引起细胞形态改变并降低细胞存活率。2.PM_2.5暴露可诱发细胞产生炎症反应。3.PM_2.5处理细胞后引起lncRNAs表达失调;长链非编码RNA LOC101927514呈上调且和PM_2.5处理有剂量-效应关系。4.长链非编码RNA LOC101927514在PM_2.5致细胞炎症发生发展过程中发挥促炎基因的作用。5.长链非编码RNALOC101927514通过引起STAT3蛋白磷酸化来共同参与炎症反应过程。