研究背景宫颈癌是严重危害女性健康的重大恶性疾病,发病率为女性恶性肿瘤的第三位,仅次于乳腺癌和肺癌,也是导致女性死亡的第二大病因。我国是宫颈癌的高发地区,有资料显示,我国每年有近13.1万例新发宫颈癌患者,近80%确诊时已有浸润转移,每年有超过5万例患者因宫颈癌而死亡。目前,宫颈癌的治疗主要依赖手术及放化疗的综合治疗手段,虽然治疗效果较为确切,但是复发转移的风险仍然很高。研究报道,尽管经过规范化的治疗,宫颈癌的复发率占35%,且近90%是在初次治疗后的3年内复发,而复发后的宫颈癌的转移仍然是治疗中遇到的最为棘手的问题,也是导致宫颈癌治疗失败及患者死亡的重要原因。同时,对于晚期宫颈癌患者,目前疗效仍缺乏确切的治疗手段。高危人乳头瘤病毒(HPV)持续性感染已确认是导致宫颈癌发生的最主要原因。近年来,随着宫颈癌筛查手段的不断进步以及HPV预防性疫苗的应用,发达国家的宫颈癌发生率和死亡率均有明显的下降。尽管已有针对HPV的预防性疫苗及可靠的宫颈癌筛查手段,但目前宫颈癌的发病仍然呈上升的趋势,因此,进一步认识宫颈癌的发生发展过程,了解其浸润转移的机制,仍然是发展有效治疗策略的重要措施。宫颈癌侵袭转移是导致其治疗失败及患者死亡的重要原因。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是肿瘤细胞侵袭转移的第一步,也是导致宫颈癌浸润转移的重要原因。上皮间质转化(EMT)是上皮细胞失去其表面标记,逐渐转化为具有活动能力的间质细胞,并失去其表面标记,获得具有浸润转移能力的过程,其表现为上皮细胞特征性的表面标记表达E-cadherin表达下调,而间质细胞表面标记如vimentin上调,同时,出现细胞活动能力增加,与周围组织的粘附能力下降,使细胞获得向远处组织浸润转移的能力。大量研究证实,EMT除了在胚胎发育及器官发生、创伤修复及组织重建、器官纤维化、慢性炎症等中发挥作用外,在肿瘤干细胞形成及肿瘤浸润转移中发挥着极为重要的作用。有趣的是,在EMT在肿瘤的转移过程中,呈现一个动态变化的过程:EMT能够促进肿瘤的局部浸润,但是肿瘤向远处器官转移过程中,首先需要形成间质上皮转化(Mesenchymal-Epithelial Transition,MET),进而转变为emt,从而导致肿瘤发生远处器官转移。这种可逆的变化表明emt不是受到遗传或者表观遗传学的调控,而是受来自于肿瘤微环境(tumormicroenvironment,tme)中的各种相关因素调控的。而emt在宫颈癌的转移中同样发挥着重要的作用,研究发现,hpv感染、致癌基因激活及肿瘤微环境的改变均可以导致宫颈癌emt的发生。而hpv感染引起的宫颈微环境的改变可能在这一过程中发挥着重要的作用。肿瘤微环境(tme)是肿瘤细胞赖以生存的外部条件,由成纤维细胞,免疫细胞,细胞外基质及由其分泌的各种细胞因子成分等构成。研究认为肿瘤微环境在抑制肿瘤免疫,提高肿瘤耐药、促进肿瘤的生长及转移方面起着重要的作用,肿瘤局部微环境为肿瘤的发展提供了一个适宜的局部环境,为肿瘤的进展转移复发耐药,提供滋生的良好环境。肿瘤微环境中的细胞因子,如肿瘤坏死因子(tnf-α),白细胞介素(il-1,6,8),转化生长因子(tgfβ),血管生成因子(vegf&plgf)以及一些非肿瘤细胞,包括巨噬细胞,淋巴细胞等,均在促进肿瘤的浸润进展方面发挥着重要的作用。hpv感染是导致宫颈癌的重要原因,也是导致宫颈局部微环境改变的重要因素,hpv持续感染导致宫颈局部持续的炎症状态,诱导并激活多种炎症细胞分泌多种细胞因子及化学成分,形成一个复杂的宫颈阴道微环境,在促进宫颈癌的发生发展中,发挥着重要的作用。hpv感染后,引起宫颈上皮恶性转化,是一个渐进发展的过程,而emt是导致转化宫颈上皮进展为侵袭性肿瘤的重要因素。宫颈癌是由宫颈上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,cin)细胞向具有侵袭转移能力的恶性细胞逐渐发展而来,某些cin病变,有可能逆转为正常宫颈上皮,这一可逆性的改变与emt类似,提示emt和cin存在某种联系,可能都是受到宫颈微环境所调控的。而hpv感染是宫颈癌的主要元凶,也是导致宫颈微环境改变的最重要因素。hpv感染可能通过改变宫颈局部微环境进而促进宫颈癌转移的发生。研究发现,胎盘生长因子(placentagrowthfactor,plgf)在肺癌及乳腺癌中的表达明显上调,同时,通过激活plgf特异性受体flt-1可以促进某些肿瘤发生emt。已有研究证实了hpv感染导致宫颈微环境改变,诱导各种炎症细胞聚集和炎症介质的释放,这其中包括plgf,这些变化可能进一步促进了已经发生转化的瘤变上皮向浸润癌的发展。同时,hpv感染后的宫颈上皮组织中,可以检测到plgf的mrna表达明显上调;而在宫颈癌组织中,研究发现,plgf及其mrna的表达水平均明显高于癌旁组织。因此,plgf作为hpv感染后,宫颈微环境中的重要成分,在肿瘤的浸润转移密切相关。胎盘生长因子(plgf)是血管生成因子家族(vegf)家族的成员之一,与其他血管生成因子家族不同的是,plgf在正常生理状态下几乎不表达或表达量极低,而在缺血、炎症及肿瘤等病理状态下,其表达量明显上调,提示plgf可能作为疾病状态下的重要生物学标记或疾病预后的重要生物学监测指标。研究发现,plgf作为一种多功能的细胞因子,可能通过多种方式促进肿瘤的发生发展,包括1.促进肿瘤血管形成2.促进肿瘤细胞的增殖3.诱导形成肿瘤局部免疫耐受状态等.因此认为plgf可能作为预测肿瘤严重程度及预后的机具价值的生物学标记。flt-1作为plgf的特异性受体,在plgf的功能发挥上,具有重要的意义,有研究发现,plgf只对表达flt-1受体的肿瘤具有促进浸润迁移的作用,而对于不表达flt-1的肿瘤细胞不具有功能。在局部缺血及炎症性疾病以及许多肿瘤包括非小细胞肺癌(nsclc),前列腺癌,乳腺癌和结肠癌,肺腺癌,肝细胞癌,胶质母细胞瘤,多发性骨髓瘤和肾母细胞瘤中,均可以观察到plgf及其受体flt-1表达的上调。研究发现,plgf可以通过激活emt信号促进包括肺癌在内的多种肿瘤的浸润转移。而在宫颈癌的研究中,研究报道证实plgf在宫颈癌组织中明显高表达,但是plgf在宫颈癌中的作用及机制,未见相关报道。因此,阐明plgf在宫颈癌中的作用及其机制,为进一步深入理解宫颈癌浸润转移的机制,开发新的宫颈癌筛查手段及治疗策略均具有重要的意义。研究目的通过检测plgf及其受体flt-1及emt相关蛋白e-cadherin、vimentin在宫颈癌及癌旁正常宫颈组织中的表达特点,分析研究各蛋白表达与宫颈癌分期、分级及淋巴结转移之间的相关性;同时,检测了宫颈癌患者血清及阴道盥洗液中plgf的表达水平与宫颈癌分期及hpv感染状态之间的相关性。采用培养的宫颈癌siha细胞系,研究plgf对宫颈癌细胞的促迁移作用及对emt相关蛋白的表达调控作用及其可能机制。为进一步了解宫颈癌浸润转移机制,开发新的宫颈癌筛查手段及治疗策略提供实验依据。研究方法1.采用he染色技术,确认所收集的组织标本取材的准确性,对所取得的准确的标本纳入后续的研究。2.采用免疫组织化学染色技术,检测plgf、受体flt-1及emt相关蛋白e-cadherin及vimentin,在宫颈癌及癌旁组织的表达情况,并分析它们之间的相关性。3.采用westernblot技术进一步检测宫颈癌及癌旁正常组织中,plgf、受体flt-1及emt相关蛋白e-cadherin及vimentin,在宫颈癌及癌旁组织的表达情况。4.采用酶联免疫吸附实验(elisa)法检测宫颈癌患者及正常对照人群血清及阴道盥洗液中,分析plgf的表达水平与hpv感染状态及肿瘤分期之间的关系。5.采用体外培养的宫颈癌siha细胞系,应用transwell法,分析研究plgf刺激对宫颈癌细胞迁移作用。6.采用westernblot方法,分析plgf处理后的siha细胞中,emt相关蛋白表达的变化。7.采用shrna-flt-1慢病毒载体感染siha细胞,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达shrna-flt-1的细胞株。8.采用正常培养的siha细胞及稳定沉默flt-1的siha细胞,并应用transwell法及westernblot技术,分析研究敲除flt-1后,plgf对siha细胞促进迁移作用及emt相关蛋白表达情况的影响。9.采用培养的正常siha细胞,预先给予erk/mapk信号通路抑制剂处理后,采用transwell及westernblot技术,观察分析erk/mapk信号被抑制后,plgf对siha细胞促进迁移作用及emt相关蛋白表达情况的影响。结果1.在110例宫颈癌组织标本中,plgf及其受体flt-1的表达明显高于对应的癌旁对照组织,它们表达的阳性率分别为61.8%和60.9%;而e-cadherin的表达明显降低占61.8%,vimentin呈高表达阳性率为59.1%。相关性分析表明,plgf及flt-1在宫颈癌组织中的高表达与e-cadherin的低表达及vimentin的表达上调密切相关(p<0.01,r=-0.618;p<0.01,r=0.450);westernblot检测进一步证实,plgf、flt-1及vimentin在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁对照组织,而e-cadherin的表达则明显低于癌旁组织。2.宫颈癌患者血清plgf的水平明显高于正常对照组(22.96±0.90ng/mlvs9.926±1.049ng/m,p<0.001),且随着肿瘤分期的进展而升高(p<0.001);在阴道盥洗液中,患者plgf的表达水平也明显高于对照组(24.80±0.73ng/mlvs11.29±0.90ng/ml,p<0.001);而血清及阴道盥洗液之间或宫颈癌i期和ii期患者之间,plgf的表达无明显差异(p>0.05)。3.hpv感染阳性患者阴道盥洗液中plgf的表达水平明显高于hpv感染阴性组(25.74±0.6258ng/mlvs11.40±0.7439ng/ml,p<0.05)。4.体外实验证实:plgf处理后的siha细胞的迁移率明显上调,而采用shrna-flt-1沉默flt-1的表达后,可以明显下调siha细胞的迁移(p<0.05),同时,plgf可以明显下调e-cadherin的表达并上调vimentin的表达,但沉默flt-1的表达后,可以逆转上述蛋白的表达。5.ERK/MAPK信号通路抑制剂PD98059处理siha细胞后,能够明显抑制PLGF对siha细胞的促进迁移作用,并能够抑制PLGF对siha细胞EMT相关蛋白的调控作用。结论1.PLGF及其受体Flt-1在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁对照组织,且与EMT相关蛋白E-cadherin在宫颈癌组织的低表达及vimentin的高表达密切相关,提示PLGF可能通过调控EMT相关蛋白的表达,发挥促进宫颈癌的浸润转移的作用,因此,追踪PLGF的表达变化有可能为预测肿瘤转移和复发提供预警。2.PLGF在宫颈癌患者血清及阴道盥洗液中的含量明显高于正常对照组,且与宫颈癌分期密切相关;而HPV感染患者阴道盥洗液中PLGF的表达水平明显高于HPV阴性人群,提示HPV感染可能是促进PLGF表达升高的重要因素,因此,动态监测阴道分泌物中PLGF的表达变化,可能为HPV感染导致宫颈癌提供佐证,而PLGF有可能成为新的宫颈癌筛查标记。3.PLGF通过激活其受体Flt-1促进宫颈癌siha细胞的迁移及调控EMT相关蛋白的表达;抑制ERK/MAPK信号通路能够抑制PLGF的上述功能,提示PLGF/Flt-1/ERK/MAPK通路在促进宫颈癌浸润转移中,发挥着重要的作用,有望为临床抑制宫颈癌转移提供新的药物研究靶点。