论文部分内容阅读
本文分为两部分：
第一部分：切割海马伞海马中65KD、83KD差异蛋白诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。
研究目的：探讨海马组织中65KD、83KD蛋白是否具有诱导神经干细胞迁移和向神经元分化的作用。
研究方法：用无血清培养技术从17天孕龄胚鼠脑中分离、克隆和扩增神经干细胞备用。取切割海马伞后14天海马和正常海马进行10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据65KD、83KD蛋白条带染色位置将未染色的含差异蛋白条带的切割组和正常组自然凝胶以及不含蛋白的空白凝胶(空白对照组)切成胶条，分为5组，每组9孔，置于2块24孔培养板各孔中，接种神经干细胞球与其共培养，共培养48小时后倒置显微镜下计数距胶条最近神经球朝胶条方向1/4扇区内迁移出的细胞数；共培养10天后，用MAP-2免疫荧光检测神经干细胞分化为神经元的情况并对朝胶条方向1/4扇区内的MAP-2阳性神经元的数量、胞体面积和细胞周长进行图象处理。用STATA7.0统计软件进行方差分析和两两比较。
研究结果：83KD切割组神经干细胞球中向着胶条方向迁移的细胞数量最多，迁移速度最快；83KD正常组神经干细胞球中向胶条方向迁移的细胞数量明显少于83KD切割组，且迁移速度较慢；65KD切割组、65KD正常组和空白对照组中细胞从神经干细胞球向四周迁移，没有方向性，且迁移速度较慢。共培养48小时后朝胶条方向1/4扇区内迁移的细胞数，83KD切割组为94.33±10.15；83KD正常组为64.83±3.97；65KD切割组为20.17±3.71；65KD正常组为18.33±2.58；空白对照组为18.17±2.92。两两比较结果显示：83KD切割组与其它各组之间均有显著性差异；65KD切割组、65KD正常组和空白对照组三组之间无显著性差异，但它们与83KD正常组之间均有显著性差异。共培养10天后，83KD切割组朝胶条方向1/4扇区内的MAP-2阳性神经元数量为42.9±5.74，胞体大、突起丰富，胞体面积为387.60±49.35μm2，细胞周长为337.84±39.84μm；83KD正常组朝胶条方向1/4扇区内的MAP-2阳性神经元数量为25.6±4.45，胞体较小，突起短，胞体面积为310.00±30.95μm2，细胞周长为234.16±40.62μm；65KD切割组、65KD正常组、空白对照组朝胶条方向1/4扇区内的MAP-2阳性神经元数量分别为2.6±1.17、2.0±1.05、1.2±0.78，胞体小，突起少而短，胞体面积分别为75.55±17.01μm2、66.75±15.14μm2、60.80±20.00μm2，细胞周长分别为48.98±14.41μm、49.73±10.81μm、37.83±11.00μm。统计结果表明，MAP-2阳性神经元数量、胞体面积、细胞周长5组之间均有显著性差异。这三项指标两两比较结果显示：83KD切割组与其它各组之间均有显著性差异；65KD切割组、65KD正常组和空白对照组三组之间无显著性差异，但它们与83KD正常组之间均有显著性差异。
研究结论：海马组织中83KD蛋白能诱导神经干细胞迁移和向神经元分化。
第二部分：切割海马伞海马中56KD、65KD、83KD差异蛋白诱导神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化的协同作用研究。
研究目的：探讨海马组织中56KD、83KD两种蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面是否具有协同作用和它们与65KD蛋白的关系，以及56KD、65KD、83KD差异蛋白对神经干细胞向AChE阳性神经元定向分化的影响。
研究方法：将切割海马伞后14天海马与正常海马组织匀浆电泳对比后，取低分子量区56KD、65KD和83KD3条差异蛋白条带进行电洗脱。将收集到的上述3种蛋白质以不同的组合分为8组，取4块24孔培养板的96个孔接种鼠胚神经干细胞球，分为8组，每板每组3孔，共12孔，加入不同的分化培养液：空白对照组加入单纯DMEM/F12无血清培养基；56KD组加入含10μg/ml56KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；65KD组加入含10μg/ml65KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；83KD组加入含10μg/ml83KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；56KD+65KD组加入含10μg/ml56KD和10μg/ml65KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；56KD+83KD组加入含10μg/ml56KD和10μg/ml83KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；65KD+83KD组加入含10μg/ml65KD和10μg/ml83KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；56KD+65KD+83KD组加入分别含10μg/ml56KD、10μg/ml65KD和10μg/ml83KD蛋白的DMEM/F12无血清培养基；12天后，取2块培养板的48孔，用MAP-2免疫荧光检测神经干细胞分化为神经元的情况；另外2块培养板的48孔用AChE组织化学染色检测神经干细胞定向分化为AChE阳性神经元的情况；并对MAP-2阳性神经元和AChE阳性神经元的数量、胞体面积和细胞周长进行图象处理。用STATA7.0统计软件进行方差分析和两两比较。
研究结果：MAP-2免疫荧光显示56KD+65KD+83KD组和56KD+83KD组MAP-2阳性神经元较多，分别为47.1±9.64、43.7±8.41，胞体较大且分化较好，胞体面积分别为404.32±87.23μm2、359.15±44.23μm2，突起较粗且长，细胞周长分别为368.34±13.48μm、358.67±11.20μm;65KD+83KD组、56KD+65KD组、56KD组和83KD组4组MAP-2阳性神经元数量较少，分别为25.6±6.15、21.5±3.02、21.4±5.70、18.7±3.89，胞体较小，胞体面积分别为232.31±40.13μm2、215.81±52.02μm2、180.1±43.74μm2、175.29±22.16μm2，突起也较短，细胞周长分别为111.91±6.20μm、115.60±9.94μm、113.40±10.33μm、109.00±7.50μm；65KD组和空白对照组仅看到少量的MAP-2阳性神经元，分别为6.6±3.89、2.6±1.58，胞体较小，胞体面积分别为66.42±22.22μm2、57.64±15.80μm2，突起短而少，细胞周长分别为39.95±2.60μm、39.47±7.16μm。统计结果表明，MAP-2阳性神经元数量、胞体面积、细胞周长8组之间有显著性差异。这三项指标两两比较结果显示：56KD+65KD+83KD组与56KD+83KD组之间没有显著性差异，但它们与其它各组之间均有显著性差异；65KD+83KD组、83KD组、56KD+65KD组和56KD组4组之间无显著性差异，但它们与65KD组和对照组之间均有显著性差异；65KD组和对照组之间无显著性差异。AChE组织化学染色显示不含83KD蛋白的4组几乎未见到典型的AChE阳性神经元，含83KD蛋白的4组中，AChE阳性神经元较多。其中56KD+65KD+83KD组AChE阳性神经元数为15±2.7，胞体较大，面积为364.48±37.39μm2，突起最多，细胞周长为272.63±38.99μm；56KD+83KD组AChE阳性神经元数量为12.5±2.88，胞体也较大，面积为345.63±50.44μm2，突起较长，细胞周长为253.75±66.06μm；65KD+83KD组和83KD组AChE阳性神经元数量分别为7.6±1.14、7.2±2.17，胞体面积分别为237.95±2、203.77±25.34μm2，细胞周长分别为140.25±21.30μm、135.38±34.01μm。方差分析和两两比较结果显示，含83KD蛋白的4组中56KD+65KD+83KD组与56KD+83KD组之间无显著性差异，但与65KD+83KD组和83KD组间均有显著性差异；而65KD+83KD组和83KD组间无显著性差异；上述含83KD的各组与不含83KD的各组间均有显著性差异；不含83KD蛋白的56KD组、65KD组、56KD+65KD组和空白对照组4组之间均无显著性差异。
研究结论：海马中83KD蛋白与56KD蛋白在诱导神经干细胞向神经元分化方面具有协同作用；83KD蛋白能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化；56KD蛋白本身不能诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化，但它可增强83KD蛋白诱导神经干细胞向AChE阳性神经元分化的作用。