目的：1．探讨鱼纲与哺乳纲动物间肝细胞移植的可能性。2．建立罗非鱼肝细胞的分离和原代培养方法。3．观察温度对罗非鱼肝细胞原代培养的影响。4．探讨罗非鱼到大鼠肝细胞移植的免疫排斥反应机理材料和方法：1．采用胶原酶冷消化法分离罗非鱼肝细胞，含多种辅助因子的DMEM培养基进行原代培养。台盼蓝拒染法测细胞活力。2．倒置光显微镜动态观察罗非鱼肝细胞的形态，透射电镜观察其超微结构。从形态学角度观察培养细胞的生物学活性和温度对罗非鱼肝细胞原代培养的影响。3．按不同培养温度分为A(28℃)、B(37℃)和C(39℃)三组。收集各组第3、5、7、9、11和13天的罗非鱼肝细胞培养上清液，检测其中白蛋白、尿素、GPT和LDH含量，并比较其差异性。从功能上判断培养细胞的生物学活性和温度对罗非鱼肝细胞原代培养的影响。4．SD大鼠随机分为移植组和对照组。对照组大鼠脾内注射生理盐水，实验组大鼠脾内移植2×10~7个罗非鱼肝细胞，在术后不同时间取大鼠脾脏。HE染色法行大鼠脾脏及移植物组织学观察。免疫组化SABC法行移植物周围IgM、IgG和CD4、CD8淋巴细胞检测。初步观察移植后发生的免疫排斥反应。结果：1．平均每条罗非鱼获得1.13±0.17×10~8个肝细胞，细胞活力92.05±0.66％，纯度92.70±0.83％。2．罗非鱼肝细胞的形态学观察新鲜分离的罗非鱼肝细胞形态完整，呈圆形或椭圆形，胞核清晰。28℃下肝细胞培养：12小时贴壁、伸展呈多角形；24小时大多数细胞完全贴壁，可见双核；3天连接成片状或岛状；5天肝细胞数明显增多，可见新生肝细胞；7天细胞约覆盖80％的瓶壁，透射电镜下可见细胞间紧密连接及胆小管样结构，以后呈平稳状态；11天少量细胞脱落；14天脱落细胞明显增多；3周绝大多数细胞脱落死亡。可见28℃培养的罗非鱼肝细胞活性良好。37℃下肝细胞培养的形态变化过程与28℃下培养基本相同。提示罗非鱼肝细胞具有耐高温性。39℃下肝细胞培养：12小时细胞伸展，24小时部分细胞贴壁，3天可见连接成片状或岛状的肝细胞；5天大部分贴壁细胞脱落；7天几乎所有细胞脱落死亡。提示39℃培养的罗非鱼肝细胞仍能短期内存活、保持活性。3．培养罗非鱼肝细胞的功能检测①组内比较观察罗非鱼肝细胞功能的变化趋势。A(28℃)组：培养上清液中白蛋白和尿素含量随培养时间延长均呈逐渐上升，然后逐渐下降的趋势；第7天白蛋白和尿素含量最高(P＜0.05)。提示罗非鱼肝细胞在培养的第7天活力最佳。培养上清液中GPT和LDH含量随培养时间延长均呈逐渐下降，然后又逐渐上升的趋势；第7天LDH、GPT含量最低(P＜0.05)。提示罗非鱼肝细胞在培养的第7天损伤最小。B(37℃)组：培养上清液中白蛋白、尿素、GPT和LDH含量变化趋势与A(28℃)组相同。可见37℃培养的罗非鱼肝细胞活力佳、具有耐高温性。C(39℃)组：培养上清液中白蛋白和尿素含量随培养时间延长均呈逐渐下降趋势，GPT和LDH含量随培养时间延长均呈逐渐上升趋势。提示39℃培养的罗非鱼肝细胞短期内仍能维持一定的活力。②组间比较观察温度对罗非鱼肝细胞原代培养的影响。A(28℃)、B(37℃)、C(39℃)三组培养上清液中白蛋白含量同期两两比较显示：各时间点，A组和B组均无显著性差异(P＞0.05)，C组和A组、C组和B组均有显著性差异(P＜0.05)。三组培养上清液中尿素含量同期两两比较的统计学结果与白蛋白相同。说明罗非鱼肝细胞具有耐高温性。即使在39℃下培养，短期内仍能保持一定的白蛋白和尿素合成能力。三组培养上清液中GPT含量同期两两比较显示：各时间点，A组和B组都无显著性差异(P＞0.05)，C组和A组、C组和B组均有显著性差异(P＜0.05)；三组培养上清液中LDH含量同期两两比较的统计学结果与GPT相同。也说明罗非鱼肝细胞具有耐高温性。即使在39℃下培养，短期内仍能保持一定的膜稳定性和活力。4．移植后组织学观察：移植后2小时罗非鱼肝细胞呈近圆形，胞核、边界清晰。4小时部分肝细胞边界不清，核固缩、核溶解，可见炎性细胞浸润。8小时镜下很难见到正常结构的肝细胞，可见炎性细胞浸润明显。5．免疫组化检查：移植后1小时大鼠脾内移植物周围可见IgM，4小时移植物周围可见CD4和CD8淋巴细胞聚集，18小时移植物周围可见IgG。结论：1．胶原酶冷消化法分离的罗非鱼肝细胞形态完整、活性良好，产量和纯度均较高，是一种较好的分离方法。2．罗非鱼肝细胞在体外37℃下培养和28℃下一样，能保持形态和功能完好达2周，第7天其生物学活性最佳。39℃下培养仍可存活3-5天、保持一定的生物学活性。罗非鱼肝细胞具有耐高温性。3．罗非鱼肝细胞移植到大鼠脾脏内可短期存活(约4-8小时)。排斥反应是导致其早期死亡的主要原因。4．体液免疫和细胞免疫均参与了罗非鱼到大鼠这种不同纲动物间肝细胞移植的排斥反应，以体液免疫诱发的超急性排斥反应为主。