研究背景宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤，次于乳腺癌，且近年来有上升趋势；死亡率居女性癌症死亡的第二位，是当今严重威胁妇女健康的主要疾病之一。宫颈癌发病的首要因素是高危型HPV(HR-HPV)感染，HR-HPV DNA通过表达病毒致癌蛋白E6、E7，引起宿主细胞的异常增殖和永生化，最终导致宫颈癌发生。但在正常细胞向肿瘤细胞的转化过程中，仅有细胞的异常增殖是不够的，细胞去分化也是癌变过程的关键步骤；因此越来越多的研究者将关注点集中在肿瘤发生过程中细胞分化程度的改变。宫颈癌的发生是一个比较缓慢的过程，整个转化过程常需要数年至数十年之久；这使得宫颈癌的早期诊断早期治疗成为可能。对于早期宫颈癌患者，尤其是年轻患者应以手术治疗作为主要的治疗方法。手术治疗可以发现确切影响预后的临床病理因素，从而使得辅助治疗更加有的放矢。在众多的预后影响因素中，肿瘤细胞分化是最本质的因素。因此，揭示在宫颈癌发生发展过程中引起肿瘤细胞分化改变的分子机制对宫颈癌防治有重要意义。众所周知，在正常胚胎发育和机体组织中，细胞的增殖和分化间存在着动态平衡；细胞内存在一套完整、严密的机制以调控增殖与分化间的平衡。在人胚胎干细胞(hESC)中就存在一个能够维持其未分化状态的复杂调控网络，由多种细胞因子和转录因子组成，包括LIF-BMP途径、OCT3/4途径、Wnt途径、Notch-Hes途径等。已有研究表明，Notch-Hes信号转导途径是调控细胞分化的关键途径。信号蛋白Notch是一种跨膜蛋白，在生物体发育过程中，通过细胞内Notch蛋白水平的高低决定干细胞的命运；并通过Notch-Hes信号转导途径而抑制细胞分化。Hes(Hariy Enhancer of Split)为Notch蛋白的下游靶基因，在胚胎发育过程中大量表达于上皮及神经上皮细胞中，Hes-1/Hes-5蛋白为碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)DNA结合蛋白，可通过直接与靶DNA或与其它bHLH蛋白(如Hash1，MyoD、E47等)结合阻断激活路径而抑制转录，最终抑制细胞分化。Notch-Hes信号途径对细胞分化、增殖的调节作用提示其在肿瘤发生、发展中的可能作用。迄今，已在许多人类实体瘤(如宫颈癌、头颈肿瘤、子宫内膜癌、肾癌、肺癌、乳腺癌、胸膜间皮瘤和涎腺肿瘤等)及血液系统肿瘤中发现了Notch1的异常表达。作为Notch1下游重要的效应因子，Hes1/Hes5基因与肿瘤发生、发展关系的报道并不多见，并且在不同组织类型的细胞中，Hes基因的作用还不尽相同。但迄今对Hes1/Hes5基因以及Notch-Hes途径对宫颈癌细胞分化、增殖的作用尚未见相关报道。本研究首先检测正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变(CIN)以及宫颈鳞状细胞癌(SCC)细胞中分化相关蛋白Hes1、Hes5的表达情况，并分析其与早期宫颈癌预后相关因素的关系，以探讨Hes1/Hes5蛋白的表达在宫颈癌的发生、发展的作用；然后应用RNA干扰技术分别沉默宫颈鳞癌细胞株(SiHa细胞)中的Hes-1及Hes-5基因，观察干扰后SiHa细胞中Hes-1/Hes-5的表达及其上、下游蛋白及与细胞分化、增殖相关指标的改变，并探讨Hes1/Hes5以及Notch-Hes信号途径与宫颈癌细胞分化、增殖的关系；旨在阐明Hes-1/Hes-5基因及其信号途径在宫颈癌细胞分化中的调节作用，并寻找能阻断抑制宿主细胞分化的关键分子，为探索宫颈癌防治新策略和新靶点提供实验依据。第一部分Hes1/Hes5蛋白在宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中的表达研究目的分别检测正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变和宫颈鳞状细胞癌中分化相关蛋白Hes1及Hes5的表达水平，初步探讨Hes1/Hes5蛋白的表达与宫颈癌的发生、发展及预后的关系。材料和方法选取2004年10月至2005年6月在浙江大学医学院附属妇产科医院病理科存档的宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞状细胞癌组织，包括轻度宫颈上皮内瘤变(CINI)31例，中-重度宫颈上皮内瘤变(CINⅡ-Ⅲ)77例，宫颈鳞状细胞癌(SCC)109例，其中高分化26例，中分化50例及低分化33例。所有病人取标本前均未接受过放、化疗及免疫治疗。在109例SCC病人中，73例早期宫颈癌(包括Ⅰa期10例，Ⅰb期59例，Ⅱa期4例)接受了手术治疗，具有完整的临床病理资料，包括(1)病人年龄，(2)临床分期，(3)肿瘤细胞分化，(4)肿瘤大小，(5)间质浸润深度，(6)淋巴结转移情况及(7)宫旁淋巴血管侵犯情况等。选择同期在浙江大学医学院附属妇产科医院病理科存档的因子宫肌瘤进行全子宫切除、经病理确诊无宫颈病变的78例正常宫颈鳞状上皮组织作为正常对照。通过免疫组织化学的方法检测Hes1、Hes5蛋白的表达情况。结果1．在正常宫颈上皮、CIN以及SCC组织中，Hes1、Hes5蛋白的表达均有显著性差异(P=0.000)；并且随着病变进展，蛋白表达有增强趋势。2．Hes1的表达在不同间质浸润深度及大小的肿瘤中表达有显著性差异(P＜0.05)，而Hes5的表达在不同临床分期、大小、间质浸润深度、细胞分化程度及淋巴结状态的肿瘤中表达有显著性差异(P＜0.05)。结论1．Hes1/Hes5蛋白过表达可能参与宫颈鳞状上皮的癌变过程；2．Hes1/Hes5蛋白的过表达有望成为预测早期宫颈癌不良预后因素的标志。第二部分Hes1/Hes5基因对宫颈癌细胞分化、增殖的调节作用研究目的探讨宫颈癌细胞中Hes1/Hes5基因及Notch-Hes途径对宫颈癌细胞分化、增殖的影响，从而明确分化相关基因Hes1/Hes5对宫颈癌细胞分化、增殖的调节作用。材料和方法通过RNA干扰(RNAi)技术分别沉默SiHa细胞中Hes1、Hes5基因，免疫细胞化学、免疫印迹检测干扰后SiHa细胞中Hes1/Hes5上下游蛋白以及分化、增殖相关蛋白的改变；MTT法检测细胞增殖力的改变。结果1．Hes1及Hes5 RNA干扰后，干扰组SiHa细胞Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表达水平相应地降低，有统计学差异(P值均为0.000)，而阴性对照(LacZ)组与空白对照(Lipo)组之间的mRNA及蛋白表达水平改变无统计学差异。2．Hes1/Hes5 RNA干扰后，RNA干扰组SiHa细胞中Hes1/Hes5下游蛋白Hash1表达显著增强，Hes1/Hes5上游蛋白Notch1表达改变无统计学差异，分化相关蛋白Nanog、SSEA-4、TRA-1-60蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)；阴性对照(LacZ)组与空白对照(Lipo)组间上述蛋白表达水平改变均无统计学差异。3．Hes1/Hes5 RNA干扰后，RNA干扰组SiHa细胞中Ki-67、PCNA蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)；MTT法检测，干扰后细胞增殖能力显著下降(P＜0.05)；而阴性对照(LacZ)组与空白对照组(Lipo)间增殖相关指标改变无统计学差异。结论1．通过RNA干扰能成功沉默宫颈癌细胞中的Hes1及Hes5基因；2．Hes1/Hes5基因抑制宫颈癌细胞分化，Hash1蛋白参与了这一抑制过程的信号转导；3．下调Hes1/Hes5基因的表达可抑制宫颈癌细胞的增殖。