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目的:随着全球工业化的不断发展,空气污染已成为主要的环境问题。大量流行病学研究证明PM2.5是诱发心血管相关疾病的重要因素。经济水平的提高逐渐改变了人们的饮食习惯和生活方式,越来越多的人出现高血脂症状。以血液中脂蛋白增高为特征的相关血脂异常被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病的主要危险因素。但PM2.5对高血脂人群心血管的影响及其机制还不清楚。本研究通过高脂饮食建立高血脂小鼠模型,通过PM2.5急性暴露来探讨PM2.5所致高血脂小鼠心脏损伤的作用及其潜在机制;并通过H9C2细胞体外实验进一步探讨PM2.5所致心肌损伤的可能机制。方法:1.PM2.5样品采集及处理:使用载有纤维素滤膜的大流量采样器收集2017年冬季大连的PM2.5颗粒物,一部分制成25mg/ml的PM2.5悬液用于体内实验,一部分制成40mg/ml的PM2.5悬液用于体外实验。每次体内或体外实验前均超声处理30min。2.实验分组及模型构建:(1)第一部分实验:动物实验部分:50只C57BL/6小鼠按体重随机分为2组(n=25),一组给予标准饲料喂养(Standard Feed Diet,STD),另一组给予高脂饲料喂养(High Fat Diet,HFD),喂食8周后,每组随机各取出5只用来检测高血脂模型的建立,再将剩下的小鼠每组随机分为4组(n=5):1)Control组:在第0天,第2天,第4天给小鼠气管内滴注20μl无菌生理盐水。2)PM2.5组:气管内滴注20μl PM2.5悬液,操作方法同Control组。3)PM2.5+NAC组:在PM2.5暴露前1h腹腔注射150 mg/kg N-乙酰-L--巯基丙氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),每2天一次直至第7天处死,其余操作与PM2.5组相同。4)PM2.5+PBS组:操作与PM2.5+NAC组相同,将腹腔注射的NAC换成等体积的PBS。(2)第二部分实验:细胞实验部分:用生理盐水,PM2.5,NAC以及对戊氨酰邻氨基苯甲酸(N-(p-amylcinnamoyl)Anthranilic Acid,ACA)分别及联合处理H9C2细胞,收集各组处理好的细胞用于检测相关指标的变化。3.相关指标检测:(1)血清中血脂及心肌酶相关指标检测按实验分组处理小鼠,取心尖血离心检测血清中胆固醇(Cholesterol,CHOL),甘油三酯(Triglycerides,TG),低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL),高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL),天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate Aminotransferase,AST),肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)和羟丁酸脱氢酶(Hydroxybutyrate Dehydrogenase,HBDH)的含量。(2)心脏组织病理损伤小鼠处死后取心脏,将心脏组织切片进行苏木素-伊红(HE)染色,观察其病理形态改变。(3)氧化应激,Ca2+相关通道和凋亡相关因子的检测动物实验:实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测小鼠心脏组织的超氧化物歧化酶1(Superoxide Dismutase 1,SOD1),谷胱甘肽过氧化酶1(Glutathione Peroxidase 1,GPX1),兰尼碱受体2(Ryanodine Receptor2,Ryr2),Bax,Bcl2基因表达量。Western blot检测小鼠心脏组织的血红素加氧酶1(Heme Oxygenase1,HO-1),Ryr2,Caspase3,Bax,Bcl2的蛋白表达量。细胞实验:CCK8检测PM2.5对H9C2的细胞毒性;流式细胞术检测H9C2细胞内ROS,Ca2+含量;RT-PCR检测H9C2细胞Trpm2,Ryr2的基因表达水平;Western blot检测H9C2细胞Caspase3,Bax,Bcl2的蛋白表达量。结果:第一部分实验(1)经8周高脂饮食后,通过检测小鼠血清发现,与STD组相比,HFD组小鼠血清CHOL,LDL的表达水平明显增高,TG的表达水平增加,HDL的表达略有增加。无论STD还是HFD组,与Control组相比,PM2.5组小鼠心脏组织HE染色心肌纤维紊乱,炎性细胞浸润及血清AST,HBDH,CK的含量增加;但是HFD+PM2.5组比STD+PM2.5组心肌纤维紊乱更严重,有更多的炎性细胞浸润,血清AST,HBDH,CK的含量增加更明显;STD+Control组与HFD+Control组相比较组织病理形态和AST,HBDH,CK的含量无显著改变。(2)无论是STD还是HFD组小鼠,与Control组相比较,PM2.5组SOD1,GPX1的基因表达降低,Ryr2,Bax/Bcl2的基因表达增高,HO-1,Ryr2,Bax/Bcl2和Caspase3的蛋白表达也增加;HFD+PM2.5组比STD+PM2.5组小鼠SOD1,GPX1的基因表达降低更显著,Ryr2的基因表达和HO-1,Ryr2,Caspase3,Bax/Bcl2的蛋白表达增加更明显;STD+Control组与HFD+Control组相比较SOD1,GPX1,Ryr2,Bax/Bcl2的基因表达和HO-1,Ryr2,Bax/Bcl2,Caspase3的蛋白表达无明显改变。(3)无论是STD还是HFD组小鼠,NAC处理均减轻了PM2.5暴露诱导的氧化应激水平,缓解了PM2.5诱导的小鼠心肌损伤。与STD组相比较,HFD组的小鼠NAC处理后,PM2.5暴露诱导的氧化应激水平降低更显著,心肌损伤减轻更明显。无论STD还是HFD组,与PM2.5+PBS组相比较,PM2.5+NAC组Ryr2和Bax/Bcl2的基因表达和及Bax/Bcl2,Caspase3的蛋白表达均明显降低,NAC对HFD组PM2.5诱导Ca2+水平和凋亡相关因子表达增加的改善更显著。第二部分实验:(1)CCK-8结果表明PM2.5对H9C2的细胞毒性具有时间依赖性和浓度依赖性。PM2.5刺激诱导细胞内ROS和Ca2+浓度增加,Ryr2,Trpm2,Bax/Bcl2基因表达增加,Caspase3,Bax/Bcl2的蛋白表达增加,细胞凋亡水平增高。用NAC预处理明显改善了PM2.5诱导的H9C2细胞内ROS,Ca2+,Ryr2,Trpm2,Caspase3和Bax/Bcl2的表达增加。ACA提前处理明显改善了PM2.5诱导的H9C2细胞内Ca2+,Ryr2,Trpm2,Caspase3,Bax/Bcl2的增多。结论:PM2.5暴露对高血脂状态小鼠造成的心脏损伤更严重,其损伤机制可能是诱导更强的氧化应激,进而诱发Ca2+稳态失衡并激活凋亡相关通路。PM2.5-ROS-Trpm2-Ryr2-Ca2+通路可能在PM2.5暴露致H9C2细胞损伤中发挥重要作用。