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研究背景及目的:2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）是一种由于机体胰岛素相对缺乏导致血糖水平异常升高的代谢性疾病。据预测至2030年,全球约有T2DM患者约3.66亿,约占总人口4.4%。糖尿病及其并发症已经成为我国及全球的重大公共健康问题。胃肠道是人体最大的内分泌器官,肠道内分泌细胞（Enteroendocrine cells,EEC）作为一种特殊肠上皮细胞,分布在胃肠道不同部位,合成并分泌20多种不同的激素,其中包括多种在维持能量平衡和葡萄糖稳态中发挥关键作用的胃肠激素,如胃饿素（Ghrelin）、胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）、抑胃肽（glucose-dependent insulinotropic peptide,GIP）、肽YY（Peptide YY,PYY）、肠促胰液素（Secretin）和胆囊收缩素（Cholecystokinin,CCK）。这些激素可以通过刺激胰腺β细胞释放胰岛素、抑制胰腺ɑ细胞分泌胰高血糖素（Glucagon）、抑制肝糖原输出、增加脂质合成等途径来维持机体葡萄糖稳态,同时还能通过延缓胃排空、抑制食欲来降低机体对营养物质的吸收。因此胃肠激素对机体血糖稳态的调控作用,尤其是对餐后血糖的调节,成为了近年来的研究热点。GLP-1是由肠道L细胞分泌的以体内葡萄糖浓度依赖的方式促进胰岛素分泌,抑制胰高血糖素分泌的降糖激素。研究发现T2DM患者中,常常出现GLP-1分泌减少及GLP-1促胰岛素分泌减弱,提示胃肠激素GLP-1的分泌与T2DM发生发展密切相关。同时,GLP-1的长效合成类似物（如利拉鲁肽）和抑制其失活的DPP4酶抑制剂（如西格列汀）等,已经成为临床上治疗T2DM患者血糖的“明星药物”。白细胞分化抗原CD36是一种介导脂肪酸转运的膜蛋白,广泛分布于肌肉、脂肪、肠道、血管、肝脏等组织,参与多种病理生理过程,如脂质转运、免疫调节、止血、粘连、血管生成和动脉粥样硬化等。人群中有大量CD36基因的单核苷酸多态位点（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）已被证实与T2DM患病风险密切相关。在人群中,还存在着CD36缺失患者,依据单核细胞及血小板CD36的缺失情况分为在单核细胞和血小板上都缺乏CD36表达的I型缺失,和仅以血小板选择性缺乏症为特征的II型缺失。现发现CD36缺失的糖尿病患者,其空腹血糖（Fasting blood glucose,FBG）、糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c,Hb A1c）和总胆固醇水平显著高于CD36非缺失人群。在动物实验中也发现,CD36全身敲除或肝脏、骨骼肌等特异性敲除均能影响组织细胞的脂肪酸、葡萄糖代谢,与机体胰岛素抵抗密切相关。肠道组织中,CD36在肠上皮细胞高表达,也表达于EEC细胞中,在介导脂肪酸吸收和脂肪酸诱导的胃肠激素CCK和Secretin分泌中起着重要作用。但尚不清楚,肠上皮细胞CD36在维持机体血糖稳态及调节胃肠激素（如GLP-1）合成、分泌的作用。本实验主要从人群、动物（CD36全身敲除小鼠及肠上皮细胞特异性CD36敲除小鼠）及内分泌细胞系（NCI-H716）三个层次,研究肠上皮细胞CD36对维持机体餐后血糖稳态及调节胃肠激素GLP-1合成、分泌的影响并探讨其机制。方法:第一部分,收集278例重庆医科大学附属第一医院和重庆医科大学附属第二医院体检中心人群及重庆医科大学附属第二医院内分泌科、肾内科患者的临床资料及外周血标本。通过流式细胞术检测外周血中血小板和单核细胞CD36的表达;ELISA法检测外周血中GLP-1水平。第二部分,选取不同年龄、不同性别、不同饮食背景（普通饮食,含有40%脂肪的高脂饮食喂养8周、含有40%脂肪及含果糖和葡萄糖饮水的高脂高糖饮食喂养8周）,CD36全身敲除小鼠(CD36-/-)及对照野生型小鼠(CD36+/+)行口服葡萄糖耐量实验、腹腔注射葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验,采用液相芯片技术检测两组基因型小鼠口服葡萄糖负荷前后血清中调节血糖的相关激素变化。第三部分,采用Cre-Loxp重组酶系统,将肠上皮细胞特异性Cre鼠（Pvillin-Cre）小鼠与CD36flox/flox小鼠交配以构建肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠(CD36flox/floxPvillin-Cre+/+);通过加热裂解法提取鼠尾DNA,验证小鼠基因型;进一步采用q RT-PCR、Western blot、免疫荧光检测CD36flox/floxPvillin-Cre+/+和对照小鼠CD36flox/floxPvillin-Cre-/-肠道CD36的表达,验证肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠是否构建成功。第四部分,选取同周龄肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠(CD36flox/floxPvillin-Cre+/+)及对照小鼠CD36flox/floxPvillin-Cre-/-、CD36-/-Pvillin-Cre+/+、CD36-/-Pvillin-Cre-/-小鼠行口服葡萄糖耐量实验、腹腔注射葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验;采用ELISA及液相芯片技术检测小鼠葡萄糖负荷前后血清中调节血糖的相关激素变化。第五部分,采用CD36小干扰RNA瞬时转染及Cas9稳定转染,构建CD36低表达的NCI-H716细胞。q RT-PCR、Western blot验证NCI-H716细胞CD36的低表达;以25mmol/L的葡萄糖处理细胞后,ELISA检测各组细胞培养上清液中GLP-1含量,并检测相关信号通路的信号因子及蛋白的表达水平。结果:第一部分,通过分析发现血小板CD36荧光强度百分比值与糖化血红蛋白呈负相关;血小板CD36平均荧光强度值与空腹血糖呈负相关、与GLP-1呈正相关;单核细胞CD36荧光强度百分比值与糖化血红蛋白呈正相关;单核细胞CD36平均荧光强度值与GLP-1呈正相关。以上结果提示外周血中CD36的表达与血糖相关指标密切相关。第二部分,通过对CD36全身敲除小鼠及野生型小鼠进行口服葡萄糖耐量实验发现:3-6M的CD36全身敲除小鼠较野生型小鼠有更好的口服葡萄糖耐量,且与性别及不同饮食无关。腹腔注射葡萄糖耐量实验发现:不同年龄段、不同饮食背景下CD36全身敲除小鼠都与野生型小鼠的腹腔注射葡萄糖耐量无明显差异。胰岛素耐量实验发现:在普通饮食背景下,不同年龄组的CD36全身敲除小鼠与野生型小鼠外周组织对胰岛素的敏感性无明显区别;而高脂饮食背景,CD36全身敲除小鼠外周组织对胰岛素的敏感性强于野生型小鼠;高脂高糖背景,CD36全身敲除小鼠外周组织对胰岛素的敏感性不及野生型小鼠。以上结果表明CD36全身缺失可以影响小鼠口服葡萄糖耐量及外周组织胰岛素敏感性,提示CD36的表达与机体血糖稳态相关。血清中血糖调节激素的检测结果表明,口服葡萄糖负荷后CD36全身敲除小鼠血清的胃肠道分泌的激素水平的变化较野生型小鼠有明显的不同,表现为降糖激素活性GLP-1呈下降趋势;升血糖激素Ghrelin呈上升趋势。以上结果提示CD36的表达可能影响胃肠激素的合成及分泌。第三部分,通过q RT-PCR检测CD36flox/floxPvillin-Cre+/+和对照小鼠CD36flox/floxPvillin-Cre-/-肝脏、胰腺、脂肪、肌肉及各肠段组织CD36m RNA水平,结果示CD36flox/floxPvillin-Cre+/+小鼠的十二指肠、空肠、回肠、结肠组织CD36 m RNA表达均低于对照组小鼠;其余组织的CD36m RNA表达,两基因型小鼠间无明显差异;Western blot及免疫荧光检测结果示CD36flox/floxPvillin-Cre+/+小鼠各肠段的CD36蛋白水平均低于对照小鼠;GLP-1与CD36免疫荧光共染的检测结果示CD36flox/floxPvillin-Cre+/+小鼠肠道GLP-1阳性的EEC细胞CD36表达也明显降低。以上结果提示肠上皮细胞特异性CD36敲除小鼠构建成功;同时EEC上的CD36也被成功敲除。第四部分,通过对肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠(CD36flox/floxPvillin-Cre+/+)及对照小鼠CD36flox/floxPvillin-Cre-/-、CD36-/-Pvillin-Cre+/+、CD36-/-Pvillin-Cre-/-小鼠进行口服葡萄糖耐量实验发现:在普通饮食背景下,与其余各组对照小鼠相比,肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠,无性别差异均出现口服葡萄糖耐量明显受损;腹腔注射葡萄糖耐量实验发现:各基因型小鼠间无明显差异;胰岛素耐量实验结果证实,肠上皮细胞特异性CD36敲除的小鼠对胰岛素敏感性仅弱于CD36-/-Pvillin-Cre-/-小鼠,而与其他基因型小鼠无明显区别。以上结果提示肠上皮细胞CD36的表达可以影响小鼠口服葡萄糖耐量。普通饮食背景下,血清血糖调节激素的检测结果示,葡萄糖负荷后肠上皮细胞特异性CD36敲除小鼠与CD36flox/floxPvillin-Cre-/-小鼠相比,空腹状态时C肽、Glucagon、总GLP-1和活性GLP-1水平均无明显差异,而口服葡萄糖负荷后,肠上皮细胞特异性CD36敲除小鼠的上述激素均较对照小鼠值低。以上结果提示肠上皮细胞CD36可能参与调节胃肠激素的合成和分泌。第五部分,q RT-PCR和Western blot的结果示,CD36低表达的NCI-H716细胞的m RNA及蛋白水平均明显低于对照组细胞,即CD36低表达的NCI-H716细胞构建成功。ELISA检测GLP-1水平,结果示CD36低表达的NCI-H716细胞,葡萄糖负荷后的GLP-1水平均明显低于对照组细胞;ELISA检测细胞内环腺苷酸（Cyclic adenosine monophosphate c AMP）的含量,结果示CD36低表达的NCI-H716细胞,葡萄糖负荷前后的c AMP水平均明显低于对照组细胞。经过c AMP激动剂Forskolin预处理两组细胞后再加以葡萄糖处理,检测GLP-1的水平,结果示CD36低表达的NCI-H716细胞,葡萄糖负荷后GLP-1的水平与对照组无明显区别;随后检测细胞内三磷酸腺苷（Adenosine 5’triphosphate,ATP）含量,结果示CD36低表达的NCI-H716细胞葡萄糖负荷前后的ATP水平均低于对照组细胞。以上结果提示内分泌细胞上CD36的表达可能通过细胞内ATP/c AMP影响GLP-1释放。结论:1、人外周血中,血小板及单核细胞CD36的表达与空腹血糖、糖化血糖蛋白、血浆GLP-1水平密切相关。2、CD36全身敲除可以影响小鼠口服葡萄糖耐量及口服葡萄糖后胃肠激素GLP-1分泌。3、本研究首次证实肠上皮细胞CD36的缺失可能通过降低胞内ATP含量,减少c AMP生成,从而抑制内分泌细胞-L细胞释放GLP-1,诱导小鼠口服葡萄糖耐量异常。综上所述,肠上皮细胞CD36对胃肠激素GLP-1的合成、分泌起到重要作用,肠上皮细胞CD36缺失诱导小鼠口服葡萄糖耐量异常。由于口服葡萄糖耐量试验能更好地反映机体餐后血糖及胰岛素敏感性的变化,现临床已将口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）2h血糖值是否大于等于11.1mmol/L列入糖尿病诊断标准,即使当OGTT值超过正常值但未达到11.1mmol/L时,这部分患者患T2DM风险显著增高,且发生T2DM相关并发症如心血管疾病等危险也显著增加。我们的研究首次发现肠上皮细胞CD36缺失可能通过影响胃肠激素GLP-1合成、分泌诱导小鼠口服葡萄糖耐量异常,揭示了肠上皮细胞CD36在口服葡萄糖后的血糖调节过程所扮演的重要角色,为糖尿病的预防、监测及治疗提供了新的干预靶点。