论文部分内容阅读
目的:作为分子伴侣的GRP78,拥有广泛的生理功能。经过文献及课题组前期工作,表明其可以参与调控HBV病毒生命周期某个或多个环节,并初步验证了GRP78可以与HBV PreS1相互作用。因此,本文将进一步研究GRP78与HBV PreS1的相互作用,以及初步研究GRP78对HBV病毒复制水平的影响,为进一步探索GRP78对HBV病毒调控作用奠定基础,希望可以为临床抗病毒治疗提供新的靶点思路。方法:⑴GRP78与HBV PreS1小肽相互作用:在大肠杆菌E.coli B834中表达GRP78蛋白,经过破菌及离心后,通过镍离子亲和层析柱纯化GRP78蛋白;根据生物信息学预测结果,合成HBV PreS1脱盐小肽(pep55,pep56,pep57,pep58,pep59,pep60);利用表面等离子共振(SPR)及等温滴定量热法(ITC)两种研究蛋白质相互作用的方法,检测GRP78与HBV PreS1的相互作用。⑵GRP78对HBV病毒复制水平的影响:分别在HepG2.2.15和HepAD38两种稳定表达HBV的肝癌细胞系,利用qRT-PCR和Western blot实验,从GRP78的mRNA和蛋白质水平验证pAd-GRP78过表达效果及干扰RNA的沉默效果;分别用pAd-GRP78及干扰RNA感染和转染HepG2.2.15和HepAD38细胞系,利用qRT-PCR、Southern blot和Western blot实验,从HBV的pgRNA、DNA和蛋白质水平检测GRP78对HBV复制水平的影响。结果:⑴GRP78与HBV PreS1小肽相互作用:经纯化获得纯度较高的GRP78蛋白;经过SPR及ITC测定GRP78与HBV PreS1小肽的相互作用,结果表明pep58和pep60无法拟合,pep55和pep57亲和力KD值在100 n M左右,pep56和pep59亲和力可以达到KD值小于10nM。⑵GRP78对HBV病毒复制水平的影响:pAd-GRP78及干扰RNA在HepG2.2.15和Hep AD38两种稳定表达HBV的肝癌细胞系中均有过表达效果及沉默效果;在HepG2.2.15细胞系中,GRP78可以上调HBV病毒的复制水平;在HepAD38细胞系,GRP78可以下调HBV病毒的复制水平。结论:GRP78与HBV PreS1小肽相互作用的实验,发现了GRP78与HBV PreS1相互作用的位点,进一步探索了GRP78与HBV PreS1相互作用的机制。同时,为通过HBV PreS1小肽抑制GRP78的活性来调控HBV病毒的活性奠定了实验基础。为了阐明GRP78对HBV病毒的影响,我们首先选择了病毒生命周期中重要的复制环节进行研究,发现GRP78对HBV病毒复制水平有一定的调控作用。