β-葡聚糖是一种广泛存在于高等禾本科植物种子中的非结构性淀粉多糖,其存在会给以大麦等为原料的啤酒工业带来麦芽汁过滤困难、啤酒早起雾浊;给以禾本科植物为基础的饲料工业带来饲料转化率降低、动物消化不良等问题。β-葡聚糖酶（EC.3.2.1.73）主要分解大麦β-葡聚糖,在食品工业中添加该酶能有效解决上述问题。目前食品工业中应用的β-葡聚糖酶主要来源于微生物,但来源于芽孢杆菌的酶普遍存在热稳定性低或者酶活低的问题,所以筛选能够生产具有优良性能β-葡聚糖酶的芽孢杆菌菌株并利用基因工程或者蛋白质工程对酶进行改造以改善酶的性能,对食品工业有重要的理论价值和应用价值。本论文主要对产热稳定性β-葡聚糖酶芽孢杆菌的筛选、β-葡聚糖酶的分离纯化和性质、β-葡聚糖酶基因的克隆和异源高效表达,以及β-葡聚糖酶的定向进化进行了研究,旨在通过基因工程和蛋白质工程对β-葡聚糖酶进行外源高效表达或分子改造,从而为β-葡聚糖酶的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下:1.产热稳定性β-葡聚糖酶芽孢杆菌的筛选及鉴定。从来自江西宜春的温泉淤泥中筛选一株产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株,命名为YC-9。该菌株所产的β-葡聚糖酶酶活达到10.7U/ml,其粗酶液在60℃保温1小时剩余酶活为78.7%。细菌菌株YC-9的16SrDNA基因序列长度为1421 bp,GenBank序列登录号为JX869996。利用GenBank数据库中BLAST软件进行同源比对以及绘制系统发育树的结果表明:菌株YC-9的16S rDNA序列与菌株Bacillus aerophilus（嗜气芽孢杆菌）、Bacillus stratosphericus（同温层芽孢杆菌）、Bacillus altitudinis（高地芽孢杆菌）的同源性最高,都为100%;在系统发育树中,菌株YC-9与Bacillus aerophilus、Bacillus stratosphericus、Bacillus altitudinis 在同一分支,亲缘关系最近。对菌株 YC-9的形态特征和生理生化特征进行鉴定,结果显示其菌落形态为白色圆形,表面光滑;能够水解淀粉并利用D-半乳糖、L-酪氨酸、柠檬酸盐等;甲基红实验为阳性,V-P实验、硝酸盐还原均为阴性。菌株YC-9除在柠檬酸盐的利用上与高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）不同外,其余特征都与之基本相同。综合菌株YC-9的16S rDNA序列和生理生化、形态特征,将其鉴定为高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）。2.对高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶进行了分离纯化并研究了其酶学性质。经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex阴离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析,从粗酶液中获得了电泳纯的β-葡聚糖酶,酶的比活力达到2β72.9U/mg,纯化倍数为36.96倍,酶活回收率为25.8%。通过SDS-PAGE分析表明该酶的分子量在27～28kDa,其最适反应温度为65℃,最适反应pH为6.0;该酶在60℃以下的温度或pH 5.0-9.0的范围内稳定。高地芽孢杆菌YC-9的β--葡聚糖酶具有严格的底物特异性,只能水解含有β-1,3和β-1,4键的大麦β-葡聚糖和地衣多糖,因此将其鉴定为内β-1,3-1,4葡聚糖酶（E.C.3.2.1.73）。该酶对地衣多糖的Km、Vmax、kcat和kcat/Km分别为3.71mg/ml、4761.9U/mg、2142.68/s 和 577.54ml/s/mg。Co2+、Fe2+、Ca2+对该酶的活性有较明显的激活作用;Cu2+、Mn2+、EDTA对酶活有较明显的抑制作用;而K+、Na+、Zn2+和Mg2+对酶活的影响不大。3.克隆了 β-葡聚糖酶基因并进行序列分析。扩增获得了高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶基因的整个ORF,长度为732bp。对该基因编码的蛋白进行生物信息学分析可知,高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶由243个氨基酸组成,预测分子量为27.47kDa;氨基酸序列与地衣芽孢杆菌B.licheniformis（P27051.1）氨基酸序列的相似性高达97%,亲缘关系最近。GH16家族的保守序列EIDIEF位于该酶氨基酸序列的第134～140位置,其催化活性中心位置分别在E134和E138。预测该酶基因的信号肽是由为87bp长度的基因编码的一段含有29个氨基酸残基的序列:MSYRVKRMLM LLVTGLFLSL STFAASASA。将高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶的氨基酸序列提交至http://swissmodel.expasy.org蛋白质在线分析服务器,预测酶蛋白的三级结构模型。结果显示,高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶的三级结构与首次从杂合酶H（A16-M）中获得的三级结构非常相近。4.实现了高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的异源高效表达。将高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶基因分别与表达载体pET-23a和pET-32a连接,构建成非融合表达载体pET-23a-Glu和融合表达载体pET-32a-Glu,将其分别转化到E.coli BL21（DE3）中,在细胞内外均获得了活性表达。其中E.coli BL21/pET-32a-Glu表达的重组β-葡聚糖酶活力相对较高,在IPTG浓度为0.4M,接种量为2%,37℃下诱导4h后,重组酶的总酶活为63.3U/ml。通过对重组酶的表达条件,包括IPTG浓度、接种量、诱导温度、诱导时间进行优化,最终使重组菌在接种量4%、IPTG浓度为0.4mM、温度为28℃、诱导时间为8h的条件下,胞外酶活达到102.67U/ml,胞内酶活达到216.67U/ml,总酶活达到319.34U/ml,比未经优化的总酶活（63.3U/ml）提高了 5倍;比原始菌的酶活（10.7U/ml）提高了约30倍。优化后的胞外和胞内比活力分别为2409U/mg 和2708.8U/mg5.进行了重组酶的SDS-PAGE电泳检测、分离纯化及性质研究。SDS-PAGE电泳显示,重组菌E.coliBL21（DE3）/pET-32a-Glu经IPTG诱导表达的重组酶,主要存在于细胞破碎上清液和沉淀中。在细胞破碎上清中,重组β-葡聚糖酶以两种形式存在,一种分子大小约为27～28kDa,另一种约为45kDa;在细胞破碎后的沉淀中,重组酶以包涵体的形式存在,分子量约为45kDa。对重组菌发酵上清液进行行酶纯化,SDS-PAGE电泳显示达到了电泳纯,分子量大小约为27～28kDa。经纯化后的重组酶的比活力达到5392.7U/mg,纯化倍数为2.24倍,酶活回收率为56.5%。对纯酶的动力学进行研究,结果表明重组酶作用底物地衣多糖的米氏常数、最大反应速度Km、催化常数kcat、专一性常数kcat/Km分别为为4mg/ml,7692U/mg,3461/s,865.28ml/s/mg。对纯酶的性质进行研究,结果显示重组酶的最适作用pH为7.0,最适反应温度为65℃;该酶在60℃以下的温度或pH 5.0-9.0的范围内稳定,其酶学性质与原始酶基本一致。6.利用易错PCR对高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶进行了定向进化研究。对高地芽孢杆菌YC-9的β-葡聚糖酶基因进行易错PCR反应的适宜Mg2+和Mn2+的浓度进行了探索。最终选择Mg2+浓度为3mM,Mn2+浓度为0.4mM即碱基突变数在5.67个左右的浓度组合进行β-葡聚糖酶基因的易错PCR反应,通过高温裂解的方法筛选高酶活突变体,最终从5000个转化子中筛选到一株高酶活突变体Glu-3060,经IPTG诱导后其胞外酶活达到138.2U/ml,胞内酶活达到336.4U/ml,总酶活为474.6U/ml,比亲本酶的酶活（319.4U/ml）提高了 48.6%。对突变酶的性质进行研究,结果表明突变酶Glu-3060的最适反应pH为5.0,比亲本酶的最适pH降低,其热稳定性与亲本酶相差不大。对突变酶的测序结果表明,突变酶Glu-3060与亲本酶相比发生了三个氨基酸的变化,分别为K142N、Q203L和N214D。采用SWISS-MODEL对突变酶Glu-3060进行三级结构预测,结果显示K142N位置靠近酶的催化位点E134和E138,Q203L位于第二个β-折叠层中的β-转角处,N214D则位于第二个β-折叠层中靠近α-螺旋的β-折叠股中,毗邻与底物发生相互作用的位点213W。通过分析得出,三处氨基酸变化分别通过改变电荷性质或者电子云密度、影响侧链中次级键的形成、氨基酸酸性的改变、侧链基团的改变等共同影响着酶蛋白的催化活性、稳定性和反应的最适pH。这些综合因素,最终使突变酶Glu-3060在催化活性提高、最适反应pH降低的基础上,依旧保持了原有的热稳定性。