手性胺是制药、精细化工等领域中广泛使用的重要结构砌块。胺脱氢酶（Amine dehydrogenase,AmDH）是由氨基酸脱氢酶经人工进化所得的能催化酮不对称还原胺化反应的非天然生物催化剂,近年来引起了广泛关注。其催化过程利用廉价的氨分子作为氨基供体,副产物只有水,是一条原子经济性高、环境友好的手性胺合成途径。但是,目前这类胺脱氢酶存在着活力水平低、底物谱窄的问题,而且其应用研究也有待于拓展。本研究中,首先通过亮氨酸脱氢酶的分子改造,获得了三个具有较高酮还原胺化活力的胺脱氢酶,进一步利用半理性设计的方法显著提高了其对长链脂肪酮底物的活力,拓展了其催化底物谱;其次,通过对亮氨酸脱氢酶的半理性设计,获得了可催化α-羟基酮还原胺化的胺脱氢酶,为手性1,2-氨基醇的不对称合成提供了新型的生物催化剂;最后,利用所创制的胺脱氢酶与其它酶进行偶联,分别构建了醇脱氢酶/胺脱氢酶和胺脱氢酶/ω-转氨酶/甲酸脱氢酶级联的多酶催化反应体系,为手性胺的合成开辟了绿色、高效和经济的新途径。首先,我们利用实验室开发的一系列野生型亮氨酸脱氢酶作为改造的模板蛋白,通过引入双突变K68S/N261L成功获得若干具有酮还原胺化活力的胺脱氢酶,并从中筛选出了活力较高的三个胺脱氢酶,它们分别为来源于Exiguobacterium sibiricum的EsAmDH、来源于Lysinibacillusfusifor 的 LfAmDH 以及来源于Bacillus sphaericus 的 BspAmDH。上述胺脱氢酶对短链的脂肪酮具有较高的催化活力,如对2-戊酮的kcat/Km分别为0.091、0.057和0.069 s-1 mM-1。此外,它们还具有较好的热稳定性（60℃的半衰期分别为450、2190和540 min）和极佳的对映选择性（ee值＞99%）。前面所获得的三种胺脱氢酶对于长链脂肪酮底物（链长在六个碳原子以上）的催化活力较低。针对这一问题,我们通过分析LfAmDH的同源建模结构及分子对接结果,鉴定出了酶活性口袋末端的两个关键的氨基酸位点（A113与T134）,推测其会对长链底物的结合产生位阻效应。通过将这两个位点的氨基酸突变为侧链较小的丙氨酸或甘氨酸,所产生的胺脱氢酶突变体A113G、A113G/T134A与A113G/T134G对于长链脂肪族酮底物（如2-己酮、2-庚酮、2-辛酮与2-壬酮等）的活力显著增强。此外,将这些突变方式应用到其它两种胺脱氢酶EsAmDH和BspAmDH（与LfAmDH的同源性分别为70.1%和95.6%）上,也产生了类似的底物谱拓展效果,表明所设计的突变方式对于拓展胺脱氢酶的催化底物谱具有一定的普适性。总之,我们通过酶活性口袋的半理性设计显著提高了胺脱氢酶对长链脂肪酮底物的催化活力,显著拓展了其催化底物谱。为了进一步拓展胺脱氢酶的合成范围,我们通过半理性设计开发了对于α-羟基酮底物具有还原胺化活力的胺脱氢酶。我们以来源于L.fusiformis的亮氨酸脱氢酶作为分子改造的模板,构建了 K68NNK/N261NNK的双点饱和突变库,通过筛选获得了几种对1-羟基-2-丁酮底物具有胺化活力的胺脱氢酶。其中,突变体K68T/N261L对1-羟基-2-丁酮的催化效率最高（kcat/Km=0.031 s-1 mM-1）,同时对其它α-羟基酮也具有催化活力。通过向突变体K68T/N261L中引入之前所开发的拓展底物口袋的突变,所获得的胺脱氢酶突变体对于长链α-羟基酮底物的活力显著增强。利用上述新的胺脱氢酶作为催化剂,成功合成了一系列S构型的邻位氨基醇产物,不仅反应转化率较高,而且对映选择性极佳（ee值均＞99%）。因此,通过本部分的研究,将胺脱氢酶的底物谱由酮类化合物拓展到羟基酮类化合物,并且利用开发的胺脱氢酶实现了一条手性邻位氨基醇高效合成的新路线。在胺脱氢酶的应用研究方面,我们利用筛选获得的醇脱氢酶ScCR与胺脱氢酶EsAmDH构建了氧化还原力自平衡的级联反应系统,实现了从外消旋仲醇到光学纯手性胺的不对称生物转化。上述两个酶的兼容性和相同的辅因子（NAD+）依赖性,促成了“一锅”反应体系中辅因子的原位自循环,避免了额外添加还原剂。利用上述氧化还原力自平衡的双酶级联反应路径,在仅仅消耗氨分子的情况下,成功将一系列廉价易得的外消旋仲醇高效地转化为相应的手性胺（转化率最高达到94%,ee值＞99%）。因此,上述酶促级联反应开创了一条简易、高效、洁净的手性胺酶促合成新路线,被Nature Chemistry（2015,7（12）.948-949）评述为:独立地描述了与Science论文（2015,349（6255）,1525-1529）相同的概念。为进一步拓展胺脱氢酶在手性胺合成领域的应用范围,我们创新性地开发了胺脱氢酶/ω-转氨酶/甲酸脱氢酶催化的“一锅”级联反应体系,实现了R构型手性胺的高效合成。ω-转氨酶催化的不对称胺化是合成手性胺的重要路线之一,但是R-选择性的ω-转氨酶一般需要使用昂贵且大幅过量的D-丙氨酸作为氨基供体,且需要原位去除副产物丙酮酸,才能获得较高的转化率,因此显著降低了该合成路线的经济性和实用性。而我们所开发的胺脱氢酶/ω-转氨酶/甲酸脱氢酶“一锅”级联反应体系以简单廉价的甲酸铵作为初始氨基供体和还原剂,经济且高效地实现了R-选择性ω-转氨酶介导的酮不对称胺化（转化率高达＞99%,ee值＞99%）,且反应的废物仅为水和二氧化碳。该路径为R构型手性胺的酶促合成提供了新的方案,不但在一定程度上克服了胺脱氢酶合成范围有限的问题,而且改善了原有R-选择性ω-转氨酶反应系统的经济可行性和环境友好性。