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一、研究背景椎间盘(Intervertebral disc,IVD)是人体重要的组织,由软骨终板,髓核及纤维环三个部分组成。IVD随着年龄的增长会发生不同程度的退变,继发引起多种临床疾病如椎管狭窄、椎间盘突出和脊柱节段不稳等,给患者和社会造成极大的经济和心理负担。IVD退变是多种因素共同作用的结果,引起其发病的原因大致可分为遗传因素、年龄因素、营养及生物力学因素等。在成年人体内,IVD是一种无血管的结缔组织,其营养来源主要是依靠软骨终板和纤维环的渗透作用。相关研究证实,营养剥夺能够诱导软骨终板细胞凋亡,进而导致软骨终板退变,最终引起整个IVD退行性改变,并且在兔髓核细胞中,营养剥夺可通过上调BNIP3(Bcl-2/adenovirus E1B 19-k Da-interacting protein 3)的表达诱导细胞凋亡进而引起IVD退变。然而营养剥夺诱导软骨终板退变过程中的分子机制尚未阐明。因此,明确营养剥夺引起软骨终板退变过程的分子机制对于防治IVD退变有重要的科学意义和社会价值。二、研究目的通过模拟椎体血供及椎体外周微循环受损的环境,在体外建立营养剥夺的细胞培养模型,研究营养剥夺对软骨终板干细胞(cartilage endplate-derived stem cells,CESCs)的影响及BNIP3信号通路在其中的可能作用,从而进一步阐明IVD的退变机制。三、研究方法在临床上获取8例退变的椎间盘软骨终板标本,从中分离提取终板的软骨细胞,用纤维连结蛋白(Fibronectin,FN)筛选获取CESCs,进行干细胞表面抗原标志物鉴定后扩大培养,选取第三代的细胞进行实验,其中对照组在正常培养条件下(DMEMF12、5m M葡萄糖、21%O2、10%血清)培养,实验组在营养剥夺条件(DMEMF12、无糖、1%O2、无血清)分别培养24 h和48 h。细胞处理后,应用流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测,实时荧光定量PCR和Western Blot分别检测BNIP3基因和蛋白表达水平的变化,免疫荧光染色检测BNIP3蛋白与CESCs线粒体的结合情况,JC-1染色法检测线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential,MMP)的变化,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3酶的活性。进一步使用BNIP3 si RNA沉默CESCs中BNIP3基因表达,转染24 h后将细胞分别在正常条件和营养剥夺条件下培养48 h,同时设置阴性干扰对照组(使用Scramble si RNA),再次对细胞凋亡率及BNIP3的表达情况进行检测。四、研究结果1.细胞鉴定结果:使用纤维链接蛋白筛选获取CESCs,并进行表面抗原标记物检测,其中CD90、CD105、CD73和CD44为阳性,而Neg CKT(包含有HLA-DR、CD19、CD34、CD11b和CD45)为阴性,结果说明:CESCs具备干细胞的特性。2.细胞凋亡率及BNIP3表达的检测结果:实验组CESCs的凋亡率(24 h:24.47%±0.97%,48 h:28.98%±0.47%)显著高于对照组(17.26%±1.84%,p<0.05);BNIP3基因及蛋白表达水平实验组显著高于对照组(p<0.05),结果说明:营养剥夺可上调BNIP3的表达,诱导CESCs的凋亡率增加。3.干扰BNIP3基因的表达后,再次检测细胞凋亡率及BNIP3表达情况:干扰BNIP3表达的实验组CESCs凋亡率(23.72%±1.21%)显著低于对照si RNA实验组(34.05%±1.43%,p<0.05);干扰组与对照si RNA组相比,BNIP3蛋白表达明显下调,结果说明:干扰BNIP3基因能够部分抑制由营养剥夺所导致的细胞凋亡。4.免疫荧光的结果:营养剥夺能够上调BNIP3蛋白的表达,并促进其与线粒体结合,导致线粒体膜电位下降。5.Caspase-3酶活性检测:组间的Caspase-3酶活性无统计学意义(p>0.05),结果说明:营养剥夺诱导细胞凋亡是通过Caspase-3非依赖性途径发挥作用。五、结论营养剥夺通过上调CESCs中BNIP3基因和蛋白的表达水平,促进BNIP3蛋白与线粒体结合导致MMP下降,最终通过Caspase-3非依赖性途径介导CESCs的凋亡。