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第一部分无义介导的mRNA降解（nonsense mediated mRNA decay,NMD）是机体最重要的转录后水平调控基因表达的机制。NMD主要识别含有由可变剪接（Alternative Splicing,AS）或者突变导致的提前终止密码子（premature terminal codon,PTC）的mRNA并将其降解,从而阻止C端截短蛋白的生成。NMD也对体内约10-20%的正常mRNA起调控作用,因而NMD的功能广泛涉及氧化应激和氨基酸缺乏应激,机体免疫调控,神经系统发育,遗传性疾病和肿瘤的发生发展等多个方面。近年来,靶向NMD已成为一种极具前景的肿瘤或某些遗传病的辅助治疗手段。然而,并非所有患者都能从抑制NMD活性中获益,因此,有必要检测患者NMD活性,以评估NMD辅助治疗其是否适合此类患者。目前,NMD活性检测方法以NMD报告基因系统和mRNA测序等为主。NMD报告基因检测全长或截短的mRNA表达水平或翻译的两种蛋白的表达水平,比较全长和截短分子的表达量来反映NMD活性。虽然报告基因系统可以直接检测NMD活性,但在测量临床样本方面仍有局限性。另一种方法是以Illumina测序为代表的二代短读长测序,可以从mRNA变化水平上间接反映NMD活性。近年来,以牛津纳米孔和Pacbio为代表的第三代长读长测序方法迅速发展。理论上,三代测序可以无读长限制直接检测DNA或者RNA分子,因此纳米孔直接RNA测序可以提供转录本全长序列以及RNA碱基修饰等常规二代测序难以获得的信息。第一部分研究结合纳米孔直接RNA测序和二代测序评估NMD活性及转录本特征。首先,采用传统NMD报告基因系统确认了 NMD抑制剂（SMG1i）的有效性。随后,利用二代测序分别对DMSO处理和SMG1i处理的两组HEK293T细胞进行了转录组测序。结果表明,二代测序虽然可以从富集的信号通路类型,mRNA转录本类型等方面反映NMD活性变化,但本研究中未检测到新转录本,也不能预测某个转录本是否为NMD底物。本研究进一步采用纳米孔直接RNA测序对上述两组样品的mRNA进行了测序。通过三代测序分析软件FLAIR,检测到了约40%的新转录本,并对转录本是否为NMD底物进行了预测。结果表明,SMG1i处理后上调的转录本中,含有PTC的转录本显著上调。基于此结果,本研究筛选了5个在NMD抑制后显著上调的转录本及其对应基因的主要转录本作为潜在的NMD标记物,并在3个人类细胞系和9个初诊前列腺癌患者的肿瘤样本和癌旁样本中用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）进行了验证。验证结果表明,三个细胞系中NMD标志物在NMD活性抑制时表达显著升高,而临床肿瘤样本NMD活性的异质性很大,但总体NMD活性呈上升趋势。本研究结果揭示了三代纳米孔测序在检测NMD活性中的优越性,且基于纳米孔测序结果建立的NMD标志物qRT-PCR检测方法有望应用于临床检测NMD活性,并最终促进靶向NMD用于肿瘤或其他疾病的辅助治疗。第二部分TP53是最早发现、最重要的抑癌基因。由TP53基因编码的p53蛋白可作为转录因子,与p53靶基因结合并激活其转录,在细胞凋亡和周期进展,DNA损伤修复,衰老,代谢等多个方面发挥重要的功能。p53表达水平主要受MDM2负向调控。MDM2通过泛素化p53蛋白C末端的赖氨酸降解p53并使p53保持在低水平,因此MDM2过表达导致p53蛋白水平过低是p53功能失活的重要原因。除MDM2,高危型HPV病毒整合在宿主细胞基因组中并表达的E6蛋白也参与了 p53功能失活。此外,TP53基因突变也是p53功能失活的原因之一。因此,阻断MDM2或E6与p53的作用以恢复野生型p53的抑癌功能,是目前肿瘤治疗的热门靶点。目前已开发多种MDM2小分子抑制剂,例如Nutlin3及其衍生物RG7388和RG7112,并在TP53野生型的肿瘤中显示出优异的抗肿瘤作用。p53具有12种异构体,可分为p53α,p53β和p53γ三大类。p53α即全长的p53蛋白,承载p53的主要功能。p53β和p53γ由TP53前mRNA的9号内含子通过可变剪接产生。由于引入了提前终止密码子,p53β和p53γ分别表达341个和345个氨基酸残基的C末端截短蛋白。p53β和p53γ的C末端缺乏泛素化位点,不易受MDM2介导的降解的影响。但这两种p53异构体保留了完整的DNA结合区域和转录激活区域,理论上具有全长p53的转录活性。研究表明,高表达p53β和p53γ的肿瘤病人比无表达或者低表达p53β和p53γ的病人具有更好的预后。由于p53β和p53γ的mRNA序列中存在PTC,因此p53β和p53γ受NMD活性的调控。抑制NMD可以显著增加p53β和p53γ的mRNA和蛋白表达水平,并且p53β和p53γ能协助p53α进一步激活p53靶基因的转录。在第二部分的研究中,本研究首次联用了 MDM2抑制剂和NMD抑制剂,并发现该联用方案在TP53野生型肿瘤细胞以及HPV18阳性的宫颈癌HeLa细胞中具有显著的协同作用,能抑制细胞增殖,促进细胞凋亡和衰老,抑制细胞周期进展,并干扰DNA损伤修复。本研究初步阐明了协同效果的机制,在TP53野生型肿瘤细胞中,MDM2抑制剂上调了 p53α的表达,SMG1i主要上调了 p53β的表达,而p53β可以协同p53α发挥作用,增强p53α的转录活性从而达到协同作用的效果;在HPV18阳性的HeLa细胞中,这两种药物可能共同影响了 E6蛋白或截短的E6蛋白与p53的相互作用。本研究为日后MDM2抑制剂及NMD抑制剂的联用方案提供了新的思路,有望用于多种TP53野生型肿瘤以及HPV阳性肿瘤。