【摘 要】
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研究背景:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一,寻找有效的治疗方法是当前医药领域面临的巨大挑战。近十年来,免疫疗法已成为肿瘤医学研究领域的热点,它有效改变了目前肿瘤的临床治疗模式。与传统的放疗、化疗、手术切除等治疗方法不同,免疫疗法在消除原发性肿瘤的同时,还可抑制肿瘤的复发和转移。虽然越来越多的证据表明,以PD-L1/PD-1免疫检查点阻断治疗、CAR-T细胞治疗为代表的肿瘤免疫疗法在临床上取
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研究背景:恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重大疾病之一,寻找有效的治疗方法是当前医药领域面临的巨大挑战。近十年来,免疫疗法已成为肿瘤医学研究领域的热点,它有效改变了目前肿瘤的临床治疗模式。与传统的放疗、化疗、手术切除等治疗方法不同,免疫疗法在消除原发性肿瘤的同时,还可抑制肿瘤的复发和转移。虽然越来越多的证据表明,以PD-L1/PD-1免疫检查点阻断治疗、CAR-T细胞治疗为代表的肿瘤免疫疗法在临床上取得了令人欣喜的治疗效果,但其也存在患者应答率低、免疫相关副作用严重等问题。小分子肿瘤免疫治疗药物的与免疫检查点抗体药物的联用,为肿瘤治疗提供了新的治疗策略。因此,研发能阻断PD-L1/PD-1免疫检查点相互作用的小分子药物是下一代肿瘤免疫疗法的新方向。土贝母苷甲（Tubeimoside I,TBM-1）是从传统中药土贝母块茎中分离出来的一种三萜皂苷,临床上用于治疗淋巴结结核、乳腺炎、乳腺纤维瘤等,但目前TBM-1的抗肿瘤研究多关注其对肿瘤细胞的细胞毒作用,有关TBM-1在肿瘤免疫治疗中的作用目前还未见报道。本研究以下调肿瘤细胞中PD-L1的表达水平为出发点,考察了 TBM-1在体外和体内的抗肿瘤效果,以及其对肿瘤免疫微环境的重塑作用,并对TBM-1下调PD-L1的机制进行了深入探讨。方法:基于流式分析的方法,对天然活性化合物库中能降低肿瘤细胞表面PD-L1水平的天然活性化合物进行筛选。Western blot检测TBM-1对人肺癌细胞H157、H460和人黑色素细胞A375、A2058中PD-L1蛋白表达,以及TBM-1对TFEB、mTOR底物（p70S6K和4EBP1）磷酸化的影响。免疫荧光和细胞共培养的方法检测TBM-1对T细胞的激活作用。荧光定量PCR方法检测PD-L1 mRNA的表达水平。激光共聚焦实验检测TBM-1作用下PD-L1在溶酶体的定位情况,Lyso-Traker染色实验检测TBM-1对溶酶体生物合成的影响。表面等离子共振技术以及细胞热转变分析（CETSA）技术分析TBM-1与mTOR的直接相互作用。TBM-1作用于LLC和B16小鼠皮下移植瘤模型后,测量瘤体积、瘤重的变化;H＆E染色检测小鼠主要脏器、生化指标变化;多色流式细胞术分析肿瘤免疫微环境中CD4+T细胞以及CD8+T细胞等的数量及功能状态（如胞内IFN-γ水平,Granzyme B表达等）差异,以及免疫抑制细胞亚群Tregs和MDSCs的变化。在LLC皮下荷瘤模型中,将TBM-1和CTLA-4单抗联合用药,检测TBM-1对CTLA-4单抗的增敏作用。结果:通过流式分析的方法对282种天然活性小分子化合物降低肿瘤细胞表面PD-L1水平进行筛选,发现TBM-1可有效降低PD-L1的表达。进一步分析证实,TBM-1能显著下调肿瘤细胞H157、H460、A375和A2058中PD-L1的水平,并且增强共培养体系中T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。LLC和B16小鼠移植瘤实验发现,TBM-1可显著抑制C57BL/6小鼠中移植瘤的生长,同时激活荷瘤小鼠肿瘤免疫微环境中CD8+T细胞的杀伤活性,但TBM-1在裸鼠体内未见明显抗肿瘤效果,证实TBM-1的抗肿瘤活性依赖于T细胞。机制研究发现,TBM-1未影响肿瘤细胞中PD-L1的mRNA水平,但TBM-1促进了 PD-L1发生溶酶体途径的降解。TBM-1可直接结合到mTOR蛋白FRB区并抑制其活性,使转录因子TFEB去磷酸化并核转位,增强溶酶体的生物合成与功能,促进PD-L1蛋白的溶酶体途径降解,从而激活CD8+T细胞的杀伤功能。此外,TBM-1还能减少MDSCs和Tregs在肿瘤组织中的浸润,解除肿瘤免疫微环境中的免疫抑制状态,发挥抗肿瘤活性。LLC小鼠移植瘤实验进一步证实,TBM-1与CTLA4抗体联用后,可进一步增加CD8+T细胞的数量和活性,并减少MDSCs和Tregs的浸润,实现对CTLA-4抗体抗肿瘤效果的增敏作用。结论:我们的研究结果揭示了 TBM-1通过直接结合并抑制mTOR蛋白的活性,激活TFEB依赖性溶酶体的生物合成与功能,促进PD-L1发生溶酶体途径降解,进而激活T细胞发挥肿瘤免疫治疗作用的新机制。本研究为将TBM-1研发成靶向PD-1/PD-L1的小分子肿瘤免疫治疗药物奠定了坚实的基础。
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