论文部分内容阅读
本文通过观察取舍怀牛膝通塞脉制剂对正常PC12细胞增殖及其对不同因素所致的PC12细胞损伤模型的保护作用,并探讨其机制在防治缺血性脑中风。选用PC12细胞常规培养后,首先通过MTT检测细胞存活率的方法进行取舍怀牛膝通塞脉制剂浓度的筛选；确定药物的安全作用浓度后,将处于对数生长期的PC12细胞分为细胞分为正常对照组、模型组、通塞脉高剂量组(5mg/ml)、通塞脉中剂量组(0.5mg/ml)、通塞脉低剂量组(0.05mg/ml)、通塞脉去牛膝高剂量组(5mg/ml)、通塞脉去牛膝中剂量组(0.5mg/ml)及通塞脉去牛膝低剂量组(0.05mg/ml),以MTT方法观察取舍怀牛膝通塞脉制剂对不同模型所造成的PC12细胞损伤模型中细胞存活率的影响。研究结果表明,各浓度的取舍怀牛膝通塞脉制剂对正常PC12细胞的存活率均有增殖活性,选用上7个浓度中的3个浓度(0.05mg/ml,0.5mg/ml,5mg/ml加减怀牛膝通塞脉制剂DMEM溶液)作用中的低、中、高观察浓度。经过谷氨酸、连二亚硫酸钠及氯化钾刺激物造成PC12细胞损伤后,均发现这些损伤模型的细胞存活率降低。给予不同浓度的取舍怀牛膝通塞脉制剂后,对谷氨酸、连二亚硫酸钠及氯化钾损伤的PC12细胞均有明显的保护作用,通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间进行比较时,没有显著性差异,表明牛膝介导中起阴性结果。各浓度的取舍怀牛膝通塞脉制剂对正常PC12细胞的存活率均有增殖活性,当通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝去牛膝组组间比较时,没有显著性差异。取舍怀牛膝通塞脉制剂对PC12细胞损伤有显著地保护作用,其发生的机制与抑制细胞内的钙超载现象、对抗自由基的损伤以及谷氨酸的兴奋性毒性有密切的关系,但是通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间比较时,没有显著性差异,证明牛膝在介导中起阴性的结果。选用PC12细胞常规培养后,首先通过MTT检测细胞存活率的方法进行过氧化氢损伤浓度的摸索筛选；确定造PC12细胞损伤的过氧化氢浓度后,将处于对数生长期的PC12细胞分为正常对照组、过氧化氢组、通塞脉高剂量组(5mg/ml)、通塞脉中剂量组(0.5mg/ml)、通塞脉低剂量组(0.05mg/ml)、通塞脉去牛膝高剂量组(5mg/ml)、通塞脉去牛膝中剂量组(0.5mg/ml)及通塞脉去牛膝低剂量组(0.05mg/ml)。200μmol/L过氧化氢被加入作为刺激物孵化4小时后,再加入终浓度5mg/ml,0.5mg/ml,0.05mg/ml的药物,继续培养24h,用MTT法测定并计算药物对H202致PC12细胞损伤的保护率；取各组细胞上清液,按照试剂盒的操作方式,测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、乳酸脱氢酶(LDH)及钙离子(Ca2+)含量,以观察取舍怀牛膝通塞脉制剂对过氧化氢作用下PC12细胞的保护作用机制。结果表明,随着过氧化氢浓度的增高,PC12细胞存活率逐渐下降。选择细胞存活率为52.3%时的过氧化氢损伤浓度200μmol/L作为损伤模型的浓度。取舍怀牛膝通塞脉制剂(5mg/ml,0.5mg/ml,0.05mg/ml)对过氧化氢致PC12细胞损伤均有保护作用。过氧化氢组细胞上清液中SOD活性、SOD抑制率降低(P≤0.05,P≤0.01),MDA、LDH、NO含量与Ca2+含量增加(P≤0.05,P≤0.01)。而各给药组能提高SOD活性及抑制率,降低LDH、MDA、NO以及Ca2+含量,与过氧化氢组比较有显著性差异(P≤0.05,P≤0.01)。但是通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间比较时,没有显著性差异。取舍怀牛膝通塞脉制剂对PC12细胞损伤有显著性保护作用,其机制与钙超载,氧化应激等因素有关,但是通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间比较时,没有显著性差异,证明牛膝在介导中起阴性的结果。体外培养PC12细胞,将细胞分为将细胞分为正常对照组、过氧化氢组、通塞脉高剂量组(5mg/ml)、通塞脉中剂量组(0.5mg/ml)、通塞脉低剂量组(0.05mg/ml)、通塞脉去牛膝高剂量组(5mg/m1)、通塞脉去牛膝中剂量组(0.5mg/ml)及通塞脉去牛膝低剂量(0.05mg/ml)。200μmol/L过氧化氢被加入作为刺激物孵化4小时后,再加入终浓度5mg/ml,0.5mg/ml,0.05mg/ml的药物,继续培养24h,用MTT法测定并计算药物对H2O2致PC12细胞损伤的保护率；另外又测定了细胞内LDH、钙离子浓度、DNA裂解定量法、荧光染色HOECHST33258及线粒体膜电位形态学检测、ANNEXIN V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡、流式细胞技术检测细胞内ROS与INOS的表达以及蛋白印迹法测试bcl-2, bax与caspase-3蛋白的表达,以观察取舍怀牛膝通塞脉制剂对过氧化氢致PC12细胞损伤通过bcl-2-线粒体-ROS-INOS途径揭示其保护作用的研究。结果表明,取舍怀牛膝通塞脉制剂对过氧化氢致PC12细胞损伤均有保护作用,不仅可以上调bcl-2蛋白的表达量、提高线粒体膜电位红／绿的比值,而且还能降低细胞内5FURA2A/M中的钙离子的浓度、降低乳酸脱氢酶活力、下调bax与caspase-3蛋白的表达量以及INOS的高效表达。但是通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间比较时,没有显著性差异。本研究表明了取舍怀牛膝通塞脉制剂可通过bcl-2-线粒体-ROS-INOS通路揭示其在的保护机制作用。但是通塞脉含牛膝组与通塞脉去牛膝组组间比较时,没有显著性差异,表明牛膝在介导中阴性结果。由于取舍怀牛膝通塞脉制剂无毒的特点,取舍怀牛膝通塞脉制剂可进一步开发治疗与氧化应激密切相关的神经退行性疾病。