论文部分内容阅读
脑血管病严重威胁着人类的健康和生命,而缺血性脑血管病约占各类中风的80%。高等动物脑内突触传递的可塑性是近30年来神经科学研究的热点,而关于其机理的研究,很多学者从不同角度进行了探讨,但是对于针刺调节突触的可塑性方面的研究非常缺乏。针刺作为一种外源性信号,是临床卓有成效的缺血性脑损伤康复手段,其作用机制是否与调节突触传递效能以调动机体的自我修复系统,从而促进脑可塑性的形成有关呢?本文从以下几个方面进行了研究。1.文献研究本部分就古代中医学关于中风的命名、病因病机以及针灸治疗中风的古代记载方面进行了论述,从而对中风的古代文献研究背景进行了深入的认识。近年来对于脑血管病的研究中发现卒中后恢复阶段,突触在结构和功能上可以进行自我修复和重建。因此本文就突触可塑性及其有关物质进行综述,为进一步研究针刺治疗脑缺血损伤机制奠定理论基础。2.实验研究本研究观察了脑缺血后不同时间段大鼠的学习记忆能力、突触超微结构的变化及突触素P38和GAP-43表达的动态变化,探讨针刺督脉经穴“百会”、“大椎”干预其变化的时效关系。2.1方法2.1.1选用健康雄性Wistar大鼠250只,随机分为假手术组(A)、缺血组(B)、缺血+电针组(C)、缺血+DL-AP5组(D)、缺+DL-AP5+电针组(E)五组,每组又分为1h、3h、6h、12h、2w五个时间段。动物模型复制沿用以往的电凝大脑中动脉法,采用热凝闭大鼠大脑中动脉致局灶性脑缺血模型。其中假手术组只作手术暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。模型复制完成后,分别将D组和E组大鼠在脑立体定位仪上进行侧脑室注射NMDAR拮抗剂DL-AP5。对于C组和E组,取督脉经穴“百会(GV20)”、“大椎(GV14)”穴进行针刺,后接电针30min。2.1.2 Y迷宫测试成绩:对于C和E,先进行电针治疗,治疗后分3h、6h、12h、2w四个时间段进行Y迷宫测试,记录不同时间段各组大鼠的成绩。2.13突触超微结构:12h、2w后,随机取25组大鼠每组各3只左心室灌注取材。参数的观察采用JEM一1200EX透射电镜,底片放大1.5万倍印相,进行电镜观察缺血区皮层突触界面参数突触间隙宽度、PSD厚度和突触界面曲率的变化及电针对其影响。2.1.4突触素P38的免疫阳性表达:250只大鼠于术后1h、3h、6h、12h、2w每个时间段分别进行左心室灌注取材后,采用免疫组化方法检测缺血区周围皮层突触素P38的免疫阳性表达及电针的累加效应情况。2.1.5 GAP-43免疫阳性表达:250只大鼠于术后1h、3h、6h、12h、2w每个时间段分别进行左心室灌注取材后,采用免疫组化方法检测缺血区周围皮层GAP-43的免疫阳性表达及电针的累加效应情况。2.2结果2.2.1 Y迷宫测试成绩脑缺血后3h,各组大鼠学习记忆能力下降,分别与假手术组比较均有显著性意义(P<0.01)。随着脑缺血时间延长至6h时,学习记忆功能反而较3h下降。脑缺血时间的延长至12h时,大鼠学习记忆能力有所提高。随着脑缺血时间继续延长至2w时,各组大鼠受到刺激后从非安全区跑至安全区所用时间明显减少,C组大鼠所用时间已接近A组,表明局灶性脑缺血大鼠已经趋向于康复。其中B组优于D组(P<0.01),C组优于B组(P<0.01),E组优于D组(P<0.01)。2.2.2突触超微结构2.2.2.1突触间隙宽度和PSD厚度方面:B组12h、2w下降均较为明显,与A组比较差异均有显著性意义(P<0.01);但是均优于同期D组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01);与E组比较,12h差异无统计学意义(P>0.05),2w差异则有显著性意义(P<0.01)。C组明显优于同期B组,12h和2w均有显著性意义(P<0.01);也优于D组和E组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01);但低于A组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01)。D组明显低于同期A组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01)。E组优于同期D组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01);但始终低于A组(P<0.01)。2.2.2.2突触界面曲率方面:B组12h、2w均下降,与A组比较差异均有显著性或非常显著性意义(12h,P<0.01;2w,P<0.05);但是均优于同期D组,分别比较差异均有显著性或非常显著性意义(12h,P<0.01;2w,P<0.05);与E组比较,12h与2w差异均无统计学意义(P>0.05)。C组明显优于同期B组,差异均有显著性或非常显著性意义(12h,P<0.01;2w,P<0.05);也优于D组(12h和2wP<0.01),优于E组(12h,P<0.01;2w,P<0.05);但低于A组(12h和2wP<0.01)。D组明显低于A组(12h和2wP<0.01)。E组优于同期D组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01);但始终低于A组(P<0.01)。2.2.3突触素P38和GAP-43的免疫阳性表达其中假手术组表达很少,C组表达最多。2.2.3.1大鼠脑缺血后1h,大鼠突触素P38和GAP-43的免疫阳性表达稍下降:2.2.3.1.1对于P38,B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01):但是低于C组和E组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01);C组平均每个高倍视野的阳性细胞数高于其他各组,分别比较差异均有极显著性意义(P<0.001);D组与A组差异无统计学意义(P>0.05);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.2.3.1.2对于GAP-43,B组高于A组、D组和E组,但是低于C组。B组分别与A组和C组及D组比较差异均有显著性意义(P<0.01),但是与E组比较差异无统计学意义(P>0.05);C组高于其他各组,分别比较差异均有显著性意义(P<0.01);D组高于A组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.2.3.2随脑缺血时间延长至3h时,大鼠P38和GAP-43免疫阳性细胞表达较1h增多:B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01);但是低于C组,两者比较差异也有显著性意义(P<0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P>0.05);C组高于其他各组,分别比较差异均有极显著性意义(P<0.001);D组高于A组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.2.3.3大鼠脑缺血后,随时间延长至6h时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达未见增加,反而降低。B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01);但是低于C组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);但与E组比较则差异则无统计学意义(P>0.05);C组平均每个高倍视野的阳性细胞数明显高于其他各组,分别比较差异均有极显著性意义(P<0.001);D组高于A组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.2.3.4大鼠脑缺血后,随时间的继续延长至12h时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达较6h明显增加。B组高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01);但是低于C组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P>0.05);C组明显高于其他各组,分别比较差异均有极显著性意义(P<0.001);D组高于A组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.2.3.5大鼠脑缺血后,随时间再延长到2周时,大鼠突触素P38和GAP-43免疫阳性细胞的表达未见到继续再增加,反而降低至3h左右的水平。可见,P38和GAP-43的免疫阳性细胞表达并不是随着时间的延长一直增加,而是一直在变化着,但是各组的P38和GAP-43的免疫阳性细胞表达虽有降低,但是仍然高于A组,说明受到创伤的脑组织仍然不能恢复到正常水平。B组平均每个高倍视野表达的免疫阳性细胞数高于A组和D组,分别与此二组比较差异均有显著性意义(P<0.01);但与E组比较差异则无统计学意义(P>0.05);C组明显高于其他各组,分别比较差异均有极显著性意义(P<0.001);D稍高于A组,两者比较差异仍然有显著性意义(P<0.01);E组高于D组,两者比较差异有显著性意义(P<0.01)。2.4结论2.4.1凝闭大脑中动脉致局灶性脑缺血动物模型,目前是动物实验研究中较为成功的模型之一,经过本实验研究证实这一造模方法可靠、可行。2.4.2大鼠脑缺血损伤后,学习记忆能力下降,可能与缺血后突触结构破坏、数量减少有关,电针可以改善缺血大鼠的学习记忆能力,可能与电针促进了突触的重建和突触联系有关。2.4.3大鼠脑缺血损伤后,其缺血区周围皮层突触界面结构参数发生了改变,表现为突触后致密物厚度下降,突触间隙宽度减小,突触界面曲率降低,导致其学习记忆能力下降,而电针能够提高缺血大鼠的学习记忆能力,可能与电针增加了突触后致密物厚度、增大了突触间隙宽度、升高了突触界面曲率有关。2.4.4大鼠脑缺血损伤后,其缺血区周围皮层中突触素P38和GAP-43的阳性表达增加,可能与脑缺血后突触结构破坏,突触前、后膜代偿,新的突触生成以建立新的突触联系有关。而电针可以提高缺血大鼠的缺血区周围皮层中突触素P38和GAP-43的阳性表达,促进突触重建,增强突触传递的效能,有利于缺血大鼠的自我恢复。2.4.5本实验研究结果表明,缺血+DL-AP5+电针组大鼠PSD厚度、突触间隙宽度及突触界面曲率均分别显著大于缺血+DL-AP5组,提示电针可在一定程度上逆转NMDAR拮抗剂DL-AP5所引起的PSD厚度、突触间隙宽度及突触界面曲率的降低,增强了突触的传递效能,从而促进脑功能的恢复。2.4.6由Y迷宫测试成绩、突触超微结构及突触素P38和GAP-43的阳性表达结果来看,突触存在可塑性,本实验研究结果表明,电针可提高缺血大鼠的学习记忆能力,促进突触重塑,增加P38和GAP-43的阳性表达,增强了突触的传递效能,从而促进缺血损伤的尽快恢复。2.4.7实验结果表明,脑缺血损伤后6h,突触间隙宽度、突触后致密物厚度和突触界面曲率相较于3h反而减小,突触素P38和GAP-43的阳性表达降低,而此时缺血大鼠的学习记忆能力也下降,说明学习记忆能力与突触的可塑性密切相关。综上所述,我们认为针刺促进了脑缺血后突触重建和突触联系,这可能是针刺治疗缺血性脑损伤的作用机制之一。