论文部分内容阅读
结核病在世界范围广泛流行，目前已成为严重的公共卫生问题，接种结核疫苗被认为是预防结核病发生与传播的最佳方法。减毒牛型结核分枝杆菌株(BCG)是目前世界上许多国家批准应用于人体的唯一抗结核疫苗。BCG对儿童保护效果较好，但对成人肺结核的保护效果较弱。因此，目前有多种类型的结核疫苗正处于实验阶段。其中融合蛋白疫苗是最有发展前景的新型结核疫苗之一。蛋白亚单位疫苗的蛋白成分仅包含保护性抗原，缺少具有自我佐剂作用的免疫成分，免疫原性较弱。因此，需要使用适当的佐剂增强疫苗的免疫效果。
为了筛选有效的结核亚单位疫苗免疫佐剂，本研究制备卡介苗多糖核酸(BCG-PSN)-二甲基三十六烷基铵(DDA)作为结核融合蛋白疫苗的佐剂，并研究其免疫佐剂效应。本研究工作包括两个方面：结核亚单位疫苗制备和疫苗免疫特性的研究。
1.结核亚单位疫苗制备本研究首先应用改良的热酚法制备了BCG-PSN，经测定其多糖和核酸含量、残留蛋白质含量均比较理想。进一步进行了BCG-PSN的异常毒性实验，应用不同浓度的样品腹腔注射BALB/c小鼠(分别按照100μg/只、6μg/只、2μg/只剂量，对照组生理盐水)，观察实验小鼠各项反应。结果显示：在选用的高中低剂量组，小鼠各项指标正常，未检测到毒性反应。实验结果表明应用改良的热酚法可以成功制备BCG-PSN，制成品安全、无毒。
随后，应用亲和层析法表达纯化了融合蛋白AMM(Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4)并将不同的待选佐剂和对照物与AMM蛋白按照比例混合。分别得到含有不同佐剂的AMM+PBS、AMM+DDA、AMM+BCG-PSN、AMM+BCG-PSN-DDA、AMM+IFA五种待选疫苗。
2.结核亚单位疫苗免疫特性的研究将上述五种待选疫苗皮下免疫C57BL/6小鼠，设立BCG、生理盐水、BCG-PSN-DDA对照组。应用ELISA及ELISPOT技术检测免疫小鼠的体液与细胞免疫反应。结果显示：与其他佐剂对照组和生理盐水对照组相比，BCG-PSN-DDA佐剂组小鼠在第3次免疫4周后血清抗体滴度较理想，细胞免疫水平较高。分别应用特异性抗原Ag85B、PPD、Mtb8.4、MPT64190-198刺激免疫小鼠脾脏淋巴细胞，并测定每1×106个脾淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞数，AMM+BCG-PSN-DDA疫苗组的结果均较为理想。根据实验结果，认为结核亚单位疫苗AMM+BCG-PSN-DDA能够引起较强的细胞免疫和体液免疫；BCG-PSN-DDA具有较强的免疫佐剂效应，能诱导体液免疫和Th1型细胞免疫应答。进一步分别检测了以不同剂量的蛋白和佐剂构建的亚单位疫苗的免疫效果，初步认为以AMM蛋白2μg、BCG-PSN 100/μg和DDA 250μg剂量构建的疫苗免疫效果较为理想。
结论：结核亚单位疫苗AMM+BCG-PSN-DDA能够诱导较强的体液免疫和细胞免疫反应，并且其诱导以。Th1型细胞免疫为主的免疫反应，是有潜力的抗结核候选疫苗；BCG-PSN-DDA是一种安全、效果较好的新型疫苗佐剂。
经佐剂和蛋白不同剂量的配伍实验，已基本确定我们构建的结核融合蛋白亚单位疫苗中蛋白和各佐剂成分的最佳剂量比，初步认为以AMM蛋白20μg、BCG-PSN 100μg和DDA250μg剂量构建的疫苗免疫效果较为理想。