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在中国女性中,乳腺癌是一高发病率和高死亡率的恶性疾病,乳腺癌一旦发生转移,会直接导致乳腺癌患者的生存率大大降低,因此,乳腺癌转移是医务工作者在乳腺癌治疗遇到的一大难题。连接蛋白(connexin,Cx)是存在于相邻细胞间的膜通道结构缝隙连接(gap junction,GJ)的基本组成单元,连接蛋白在人类乳腺组织中主要表达Cx26、Cx43;有关连接蛋白43调节恶性肿瘤转移的机制研究发现,Cx43介导了相邻细胞间双向性、直接的电或化学信号交流,在乳腺癌转移时伴随有Cx43的表达增加和细胞间信息交流的紊乱。研究发现,在Cx43的启动子上存在着多个转录因子的结合位点,例如:转录因子SP-1(specificity protein-1)、SP-3、AP-1(activator protein-1)、c-jun等等,多种化学或物理刺激通过这些转录因子在转录水平调节了Cx43基因的表达。但是,转录水平的调控因素众多,关系复杂,mRNA需要翻译成蛋白质发挥作用,一个分子最终的功能体现在蛋白质水平;我们的前期研究发现,Cx43的转录后调控可能参与了乳腺癌腋窝淋巴结转移的调节,但有关Cx43的转录后调控在乳腺癌远处转移中的作用尚不清楚。有研究发现,Cx43具有抑制细胞内肌球蛋白轻链磷酸酶活性、促进肌球蛋白磷酸化的作用,而肌球蛋白轻链磷酸酶和肌球蛋白是细胞骨架中重要的调节酶和动力系统,细胞骨架的改变可以导致癌细胞与细胞外基质粘附性和迁移能力异常,对于维持细胞形态、恶性肿瘤转移、基因表达起着重要作用。微小RNA(microRNA,miRNA)是最大的一类基因表达转录后调控因子,有关乳腺癌中miRNA的研究发现,多种miRNA通过多个目的基因参与了乳腺癌转移的调节,前期研究中,我们前期以手术切除的人乳腺癌原发灶和配对转移的腋窝淋巴结为研究对象,研究了微小RNA-206(microRNA-206,miR-206)的表达和Cx43蛋白表达的变化关系,结果发现,在乳腺癌发生腋窝淋巴结转移时miR-206的mRNA表达明显降低,而Cx43的蛋白表达明显增加,二者有明显的负相关关系。上述研究提示miR-206可能在乳腺癌腋窝淋巴结转移中发挥重要作用,而Cx43可能是其下游调控分子。但是,miR-206是否确实通过Cx43调节了乳腺癌的远处转移及其机制尚不清楚,本研究通过生物信息学预测的方法寻找miR-206与Cx43可能的结合位点,选择人乳腺癌细胞系MCF-7及MDA-MB-231,通过慢病毒转染的方法分别提高和降低miR-206的表达,并观察随之而来的Cx43的改变以及这些变化给乳腺癌细胞诸如增殖能力,侵袭迁移能力,凋亡率和生长周期的细胞生物学特性带来的影响。实验方法和主要结果1、miR-206与Cx43表达的相互关系研究:方法:(1)通过生物信息学预测软件TargetScan和PicTar筛查与Cx43基因——GJA1最配对的miRNA。(2)以荧光素酶配对结合实验,针对Cx43基因的3’UTR和预测作用位点,通过系列PCR克隆、基因突变技术构建了Cx43-3’UTR position478-484和position1609-1615的突变质粒,观察miR-206对不同突变位点质粒中荧光素酶活性的影响,确定miR-206对Cx43的可能作用位点。(3)通过选取文献报道Cx43高表达的乳腺癌细胞株MCF-7及Cx43低表达的乳腺癌细胞株MDA-MB-231,通过免疫荧光的方法证实两种细胞株中Cx43的表达情况;(4)通过qRT-PCR方法检测两种细胞株中miR-206的表达情况。结果:(1)MCF-7细胞中miR-206的表达量明显低于MDA-MD-231细胞,MCF-7细胞中的Cx43表达高于MDA-MB-231细胞。(2)荧光素酶配对结合实验提示在position478-484突变后抑制效率降低了46.80%;在position1609-1615突变后抑制效率降低了16.72%;全部突变后抑制完全消失。表明miR-206负向调控Cx43的表达是通过其3’UTR的两个特定位点实现的,position478-484发挥的作用可能要强于position1609-1615。2、miR-206通过调节Cx43表达从而影响乳腺癌细胞生物学特性的初步机制研究方法:(1)通过慢病毒转染MCF-7细胞过表达miR-206,采用qRT-PCR及Western-blot方法检测Cx43的mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力,流失细胞仪检测细胞凋亡及生长周期。(2)通过慢病毒转染MDA-MB-231细胞抑制miR-206表达,采用qRT-PCR及Western-blot方法检测Cx43的mRNA和蛋白表达水平,CCK-8法检测细胞增殖能力,Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力。结果:(1)过表达MCF-7细胞中miR-206后,细胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明显下降,细胞增殖能力和侵袭迁移能力也明显减弱。细胞凋亡实验表明:过表达miR-206后,细胞凋亡率明显增加。细胞周期实验表明:过表达miR-206后,细胞周期阻滞在了G2期。(2)抑制MDA-MB-231细胞中miR-206表达后,细胞中Cx43的mRNA水平及蛋白水平均明显上升,细胞增殖能力和侵袭迁移能力也明显增强。结论:1.干预miR-206的表达可引起Cx43mRNA水平和蛋白水平的表达改变;miR-206与Cx43两者的表达呈负相关关系;miR-206可能通过指导mRNA降解和抑制蛋白质翻译两种机制调节Cx43表达。2. miR-206可能通过Cx43-3’UTR的position478-484和position1609-1615调控了Cx43的表达,进而调节了乳腺癌的远处转移。3.干预miR-206的表达后,乳腺癌细胞的增殖能力、侵袭迁移能力、细胞凋亡及细胞周期都受到了影响。过表达miR-206,乳腺癌细胞增殖能力减弱,侵袭迁移能力减弱,细胞凋亡率增加,细胞周期阻滞在G2期;抑制miR-206表达后,乳腺癌细胞增殖能力增强,侵袭迁移能力增强。4. miR-206可能通过调节Cx43的表达从而改变细胞骨架进而参与了调节乳腺癌细胞的恶性程度及远处转移能力。