论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinson’s Disease, PD)是一种常见的神经退行性疾病,主要病理学特征是黑质致密带(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元的脱失及黑质纹状体多巴胺能神经通路变性,导致纹状体轴突末梢的多巴胺耗竭,从而产生运动障碍。至今,帕金森病的发病机制仍不很明确,与遗传、环境、氧化应激、兴奋性毒性、自身免疫、细胞凋亡等多种因素有关。近年来,对帕金森病患者多巴胺能神经元死亡机制的研究已经证实：细胞凋亡在帕金森病发病中起着重要的作用,电镜技术等在帕金森病病人大脑的黑质发现了凋亡小体等细胞凋亡的形态学证据。P物质(substanceP, SP)是人类发现最早的神经肽,是速激肽(neurokinin, NK)家族中的一种,对NK-1受体亲和力较高,广泛存在于神经系统。作为神经递质、神经调质或者神经营养因子,P物质参与多种生理和病理过程,包括抗焦虑、抗抑郁、学习记忆、神经保护和神经变性等。有研究显示,P物质对多巴胺能神经通路,特别是黑质纹状体通路起重要的调节作用。为此,我们观察了P物质对离体多巴胺能神经元是否具有保护作用及其可能的机制。培养多巴胺能神经细胞系MES23.5细胞,应用神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶阳离子(1-methyl-4-phenylpyridinium ion, MPP+)诱导多巴胺能细胞损伤,人工合成的选择性作用于NK-1受体的激动剂[Sar9,Met(02)11] Substance P(SMSP)及拮抗剂SR140333B作用于细胞,应用MTT、Hochest染色、流式细胞仪分析技术等综合实验手段,阐明P物质对MPP+诱导的MES23.5细胞损伤具有保护作用,并初步探讨了其保护作用的可能机制。实验结果如下：1.MES23.5细胞上有NK-1受体的广泛表达。2.MPP+单独作用24h后,细胞的存活率明显下降,与对照组相比有统计学意义(P<0.01)。预先应用SMSP(10-9-10-5mol/L)孵育24h之后,再加入MPP+共同作用24h,细胞存活率明显上升,其中以10-7mol/L浓度SMSP的作用最强,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.01)。同时应用特异性NK-1受体阻断剂SR140333B与SMSP共孵育,可明显阻断SMSP的细胞保护作用,细胞存活率较单独使用SMSP明显下降(P<0.01)。3.MPP+处理的MES23.5细胞出现了明显的细胞凋亡的形态学改变,如细胞核固缩,核碎裂等,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SMSP预孵育24h后,能够明显拮抗MPP+引起的凋亡形态学改变,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SR140333B和SMSP共孵育可明显阻断SMSP的保护作用,与SMSP单独处理组相比有统计学意义(P<0.05)。4.MPP+处理的MES23.5细胞内活性氧(reactive oxidative species,ROS)生成增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SMSP预孵育能够明显拮抗MPP+引起ROS水平的增加,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SR140333B与SMSP共孵育可明显拮抗SMSP的保护作用,与SMSP单独处理组相比有统计学意义(P<0.05)。5.MPP+处理的MES23.5细胞凋亡效应酶(Caspase-3)的活性明显增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SMSP预孵育可明显拮抗MPP+所致的Caspase-3的相应改变,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SR140333B和SMSP共孵育可明显拮抗SMSP的作用,与单独SMSP组相比有统计学意义(P<0.05)。6.MPP+处理的MES23.5细胞线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potential,△Ψm)降低,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SMSP预孵育能够明显拮抗MPP+引起的线粒体跨膜电位的改变,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SR140333B与SMSP共孵育可明显拮抗SMSP对线粒体膜电位的作用,与单独SMSP孵育组相比有统计学意义(P<0.05)。7.MPP+处理的MES23.5细胞钙离子内流(calcium influx)增加,与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SMSP预孵育能够明显拮抗MPP+所致的钙离子内流的增加,与MPP+处理组相比有统计学意义(P<0.05)。应用SR140333B与SMSP共孵育可拮抗SMSP抑制钙离子内流的作用,与单独SMSP组相比有统计学意义(P<0.05)。综上所述,NK-1受体在体外培养的MES23.5细胞上有表达。SMSP预处理MES23.5细胞,可明显减轻MPP+的细胞毒性作用,其细胞保护作用的机制可能是通过拮抗MPP+所致的细胞凋亡,ROS生成增加,Caspase-3活性增加,线粒体膜电位降低以及Ca2+内流增加等多条途径实现的。应用特异性NK-1受体阻断剂SR140333B可完全阻断SMSP的细胞保护作用,进一步证实SMSP的细胞保护作用是通过激活NK-1受体实现的。本实验为深入探讨P物质对帕金森病的预防及治疗提供了一定的理论和实验依据。