目的：　　本研究通过体外实验观察血管生成素-1 （ angiopoietin-1, Ang-1 ）对内毒素（ lipopolysaccharide, LPS ）诱导的人胰腺导管上皮细胞（ Human pancreatic ductal epithelial cells, HPDE6-C7）炎性损伤的影响，观察此过程中Ang-1对微小RNA-126 （ MicroRNA-126, miR-126 ）的作用， miR-126 与程序性细胞死亡因子 4 （programmed death cell 4, PDCD4）之间的相互作用，以及Ang-1和PDCD4对核转录因子κB （ Nuclear factor-kappa B, NF-κB ）和 c-Jun氨基末端激酶（ c-Jun N-terminal kinase, JNK ）信号通路相关因子 p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、JNK、p-JNK、c-Jun和p-c-Jun表达的影响，探讨Ang-1对急性胰腺炎（Acute pancreatitis, AP）表达机制和临床治疗的意义。　　方法：　　1、HPDE6-C7细胞分别用 LPS + 磷酸盐缓冲液（ phosphate buffer saline ， PBS ）和LPS+Ang-1处理， LPS使用浓度是10 μg/mL ， Ang-1是300 ng/mL。CCK-8检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白印迹法（western blot）检测细胞凋亡相关蛋白，qRT-PCR和ELISA分别检测炎症因子的mRNA和蛋白质表达水平。Western blot检测NF-κB和JNK信号通路蛋白因子（p-IκBα、p-P65、p-JNK和p-c-jun）的表达。　　2、将实验细胞分成4组：PBS组、Ang-1组、LPS+PBS组，LBS+Ang-1组，采用qRT-PCR检测各组HPDE6-C7细胞中miR-126的相对mRNA表达水平。为了进一步检测miR-126对LPS诱导的HPDE6-C7细胞损伤的作用，HPDE6-C7细胞用LPS+scramble或LPS+miR-126 mimic分别处理，CCK-8检测细胞活性，流式细胞仪检测细胞凋亡，western blot检测凋亡相关蛋白因子表达水平，ELISA和qRT-PCR分别检测炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白质浓度和mRNA水平。　　3、实验分4组：scramble组（阳性对照）、NC（阴性对照）、miR-126 mimic组（细胞转染miR-126 mimic）和miR-126 inhibitor（细胞转染miR-126抑制剂）。qRT-PCR和western blot分别检测以上4组细胞中PDCD4的mRNA和蛋白质表达水平。为了进一步确认miR-126是否靶向PDCD4，使用双荧光素报告实验进行检测，构建两种载体：PDCD4野生型（ PDCD4-Wt ）和PDCD4突变型（ PDCD4-Mt），然后scramble实验组和miR-126 mimic实验组的细胞分别转染载体，测定荧光素酶活性。用LPS、LPS+miR-126 mimic或LPS+miR-126 mimic+pc-PDCD4转染HPDE6-C7细胞，未转染细胞作为对照，然后用western blot检测各组细胞中p-IκBα、p-P65、p-JNK和p-c-jun的表达水平，研究过表达PDCD4是否激活NF-κB和JNK信号通路。　　结果：　　1、Ang-1减轻LPS诱导的胰腺细胞炎症损伤　　CCK-8和流式细胞仪检测结果显示，LPS降低细胞活性，增加细胞凋亡，但LPS+Ang-1组与LPS+PBS组相比，显著增加细胞活性（83.67 ± 8.08%vs. 60.67 ± 7.09%， P=0.0192 ， n=3 ）和降低细胞凋亡率（ 8.47 ± 0.67%vs. 11.8 ± 1.08%， P=0.0012，n=3）。Western blot检测凋亡相关蛋白的结果显示LPS降低抗凋亡蛋白（Bcl-2）的表达，增加促凋亡蛋白（cleaved caspase-3）的表达，而Ang-1又增加Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白（Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9）的表达，这与流式细胞仪检测结果基本一致。而且，LPS增加细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA表达和释放， LPS+Ang-1组与LPS+PBS组相比，可显著降低TNF-α （67 ± 7.21 vs.136.7 ± 10.65，P=0.0057，n=3）、IL-1β（ 22.33 ± 0.67 vs. 57.67 ± 2.84 ， P=0.0003 ， n=3 ）、IL-6 （ 6.2 ± 0.55 vs. 10.5 ± 0.96 ， P=0.0178 ， n=3 ）、IL-8 （ 45 ± 2.08 vs. 79.33 ± 3.84 ， P=0.0014 ， n=3 ） mRNA和相应蛋白（分别是607.67 ± 66.05 pg/ml vs. 947.33 ± 5.89pg/ml；385 ± 67.78pg/ml vs. 597 ± 71.63pg/ml；230.33 ± 61.4pg/ml vs. 480.67 ± 92.48pg/ml；537.66 ± 75.50pg/ml vs. 767.33 ± 100.75pg/ml，P<0.05，n=3）的表达和释放。Western blot检测结果显示， LPS增加p-p65、p-IκBα、p-JNK和p-c-Jun信号通路蛋白因子的表达，而Ang-1又抑制了这些蛋白因子的表达。　　2、Ang-1和miR-126在LPS诱导的胰腺损伤中的相互作用　　qRT-PCR检测结果显示，Ang-1组与PBS组、LPS+Ang-1组与LPS+PBS组相比显著升高 miR-126 的表达（ 2.17 ± 0.32 vs. 1 ；1.53 ± 0.15 vs. 0.63 ±0.15 ， P<0.05，n=3）。然而，LPS+Ang-1组与Ang-1组相比，miR-126显著降低（1.53 ± 0.15 vs. 2.17 ± 0.32：P<0.05，n=3）。LPS+Ang-1组与LPS+PBS组相比，miR-126转染后细胞活性显著增加（82 ± 7%vs. 64.67 ± 7.5%，P=0.002，n=3），细胞凋亡率显著降低（7.57 ± 0.83%vs. 12.53 ± 1.11%，P<0.05，n=3），Bcl-2表达增加， Bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9表达降低，并显著降低TNF-α（67.67 ± 4.05 vs. 143 ± 5.29，P=0.0003, n=3）、IL-1β(26.33 ± 2.72 vs. 0.67 ± 3.71, P=0.0017, n=3)、IL-6 （ 6.33 ± 0.37 vs. 12.33 ± 0.88, P=0.0033 ， n=3 ）、IL-8 ( 28.67 ± 1.20 vs. 84.67 ± 3.71, P=0.0001 ， n=3)mRNA和相应蛋白质（分别为 547 ± 96.59pg/ml vs. 1082.66 ± 198.7pg/ml；365.66 ± 95.42pg/ml vs. 660.66 ± 63.75pg/ml；267.67 ± 73pg/ml vs. 449.3 ± 76.63pg/ml；472.33 ± 88pg/ml vs. 756.67 ± 156.8pg/ml，P<0.05， n=3）的表达水平和释放。　　3、miR-126与PDCD4在胰腺细胞中的相互作用　　qRT-PCR结果显示， miR-126 mimic组与scramble组相比显著降低PDCD4表达水平（0.27 ± 0.07 vs. 1，P<0.0001，n=3），然而，miR-126 inhibitor组与NC组相比显著增加PDCD4表达（2.1 ± 0.3 vs. 1，P<0.0001，n=3）。Western blot检测得到类似的结果。双荧光素报告实验显示，miR-126 mimic组与scramble组相比转染PDCD4-Wt细胞荧光素酶活性显著降低（0.74 ± 0.065 vs. 1，P=0.0026，n=3），但是scramble组和miR-126 mimic组转染PDCD4-Mt载体后并未观察到荧光素酶活性显著变化（0.98 ± 0.079 vs. 0.96 ± 0.065，P>0.05， n=3）。Western blot检测结果显示LPS和PDCD4增加IκBα、P65、JNK和c-jun的表达，但miR-126抑制以上这些蛋白的表达。　　结论　　1. Ang-1通过增加细胞活性，降低细胞凋亡和降低促炎症因子分泌对LPS诱导的HPDE6-C7细胞炎症损伤有保护作用，并抑制了LPS诱导的NF-κB和JNK信号通路的活化。　　2. Ang-1增加miR-126的表达，miR-126通过增加细胞活性、降低细胞凋亡和减少促炎性因子的分泌来保护LPS诱导的HPDE6-C7细胞炎性损伤。　　3. miR-126负向调控PDCD4，过表达PDCD4通过激活NF-κB和JNK信号通路，抑制miR-126的作用。　　意义：　　急性胰腺炎（AP）是发生在胰腺的急性炎症性疾病，分为轻度和重度。大约有80%AP是轻度症状，20%重度患者可能会产生多器官功能衰竭，甚至死亡。尽管在过去几年，针对AP的治疗措施被不断优化，但重度AP患者的死亡率并没有下降。　　据报道，很多促炎性因子与重度AP患者的多器官衰竭有关。如白介素6 （interleukin-6, IL-6）、IL-8、可溶性白细胞介素2受体（soluble IL-2 receptor, sIL-2R）、IL-10和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNF-α）在各种类型的器官衰竭患者中表达水平都很高。Ang-1是酪氨酸激酶受体（Tie-2）激动剂，主要通过抑制等离子体溢出，抑制血管炎症和防止内皮细胞死亡。实验发现Ang-1转染间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）可显著降低胰腺损伤和炎症。微小RNA （MicroRNAs, miRNAs）是内源性非编码的小RNA，研究表明如miR-216、miR-126、miR-217和miR-375等可作为急性胰腺炎的诊断和预后生物标记。　　近年来，随着分子生物学研究越来越受到关注，关于AP也发现了更多新的治疗靶点。我们在以往研究的基础上，将Ang-1、miR-126和PDCD4应用于AP的研究，发现它们对LPS诱导的AP具有显著的调控作用，期望以Ang-1、miR-126和PDCD4为药靶的基因治疗方法在一定程度上实现对AP的有效控制，也为AP的治疗提供更多的理论指导。